PD98059對缺糖缺氧再灌注損傷神經母細胞瘤細胞的保護

王奕海 謝露

摘要： 目的：探討PD98059對缺糖缺氧再灌注損傷神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）細胞的保護作用 方法：將SH-SY5Y細胞隨機分為正常組（Control組）、DMSO組、缺糖缺氧再灌注性損傷組（OGD/R組）、PD98059低劑量組（PD98059-L）、PD98059中劑量組（PD98059-M）、PD98059高劑量組（PD98059-H），DMSO組給予0.1%DMSO，PD98059-L、PD98059-M、PD98059-H分別給予10、30、50μmol/L的PD98059，24 h后OGD/R組、PD-L組、PD-M、PD-H組進行缺糖缺氧處理4 h，隨后復氧24 h。采用CCK-8法測算細胞存活率; Western blotting法檢測細胞中Caspase-3蛋白。結果? PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組細胞存活率高于OGD/R組（P均<0.05），逐漸增加。OGD/R組Caspase3相對表達量高于Control組、DMSO組，PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組Caspase3相對表達量低于OGD/R組（P均<0.05）。Caspase3相對表達量逐漸降低，兩兩比較，P均<0.05。結論? PD98059可保護缺糖缺氧再灌注損傷的SY-SY5Y細胞，提高細胞存活率，降低細胞凋亡率。

關鍵詞：PD98059;缺糖缺氧再灌注損傷;SH-SY5Y細胞

【中圖分類號】R73?? 【文獻標識碼】A??? 【文章編號】2107-2306（2020）02-311-01

腦卒中是人類神經系統殘疾的主要原因，發病人群已經出現年輕化趨勢，嚴重影響人民的身體健康和生活質量，給患者和社會照成了沉重的經濟負擔。腦卒中治療原則是恢復缺血區域的血液供應。 目前對其急性治療的治療方法僅依靠通過藥理溶栓和/或機械血栓切除術恢復血流^[1]。 然而，它可以加重缺血后腦組織的損傷。 因此，迫切需要開發出療效高，副作用少的新型藥物來治療中風和保護神經元^[2]。細胞外信號調節激酶（ERK）為絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的成員之一，可被氧自由基激活，介導細胞凋亡^[3]。ERK抑制劑PD98059則可保護神經細胞免受細胞氧化應激引起的細胞凋亡^[4]。本實驗以神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y為研究對象，在體外構建OGD/R模型以模擬腦缺血缺氧再灌性損傷模型，觀察PD98059對OGD/R的SH-SY5Y細胞存活率、凋亡蛋白Caspase-3表達的影響。

1? 材料與方法

1. 細胞與主要實驗材料 SH-SY5Y細胞株購自武漢大學細胞庫。MEM培養基、胎牛血清和L-谷氨酰胺購自Gibco公司。CCK-8、DMSO為美國Sigma公司產品。PD98059購自美國Selleck公司。一抗（Caspase-3 Rabbit mAb）購自Cell Signaling Technology公司。酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2? OGD處理時間篩選? SH-SY5Y細胞在鏡下觀察至70%融合時，制成細胞懸液，種植于96孔板內，每組設置3個復孔，培養24h后，加入無糖DMEM， 將培養板至于三氣培養箱（94%N₂、5%CO₂、1%O₂）培養2.0、4.0、6.0 h。處理完后換成完全培養基，在正常培養箱中培養24 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液后培養3 h，用酶標儀檢測OD值。實驗重復3次。OGD處理2.0、4.0、6.0 h后細胞存活率分別為89.03%±3.99%、55.65%±1.95%、34.54%±2.78%。選取細胞存活率在50%～60%的作用時間段即OGD 4h作為后續實驗條件^[5]。

1.3? 細胞分組、模型制作及PD98059干預? SH-SY5Y細胞復蘇后接種于含5%胎牛血清的高糖MEM中，于37 ℃、5% CO₂的培養箱中培養，細胞重懸鋪板，取對數生長期細胞做實驗。取良好的SH-SY5Y細胞，隨機分為正常對照組（Control組）、DMSO組（DMSO組）、模型組（OGD/R組）、PD98059低劑量組（PD98059-L組）、PD98059中劑量組（PD98059-M組）、PD98059高劑量組（PD98059-H組）。Control組和OGD/R組加入完全培養基，DMSO組加入含0.1% DMSO的培養基，PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組分別加入終濃度為10、20、30 μmol/L的培養基。培養24 h后，Control組和DMSO組加入正常培養基，常規培養。OGD/R組、PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組換成無糖培養基，OGD處理2 h后，換成正常培養基，在培養箱中培養24 h。

1.4? 細胞存活率測量 按照CCK-8檢測試劑盒說明書檢測各組細胞培養液中細胞存活率。

1.5? Caspase3蛋白檢測 收集各組細胞，按照蛋白提取試劑盒、BCA試劑盒提取蛋白并檢測蛋白濃度。每個樣本加樣量為100 μg;用Western blotting法檢測Caspase3蛋白相對表達量。

1.6? 統計學方法? 數據采用SPSS19.0統計軟件分析，各組數據以平均數±標準差表示，各組間采用單因素方差分析（ANOVA）， 以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1? 各組存活率比較? Control組、DMSO組、OGD/R組、PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組細胞存活率分別為100%、94.65%±4.62%、54.25%±3.57%、64.72%±4.63%、76.28%±4.62%、88.72%±6.91%。PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組細胞存活率逐漸增加，兩兩相比，P均<0.05，有統計學意義。

2.2各組細胞中Caspase-3蛋白表達情況

Control組、DMSO組、OGD/R組、PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組細胞中Caspase3表達量分別為0.20±0.21、0.21±0.02、0.37±0.06、0.31±0.05、0.26±0.06、0.22±0.05。OGD/R組Caspase3相對表達量高于Control組、DMSO組（P均<0.05）;PD98059-L組、PD98059-M組、PD98059-H組Caspase3表達量低于OGD/R組，且表達量降低，兩兩比較，P均<0.05，有統計學意義。

3討論

腦卒中具有高病死率和高致殘率，且逐漸呈現年輕化趨勢。本研究初步探明了ERK抑制劑PD98059對SH-SY5Y細胞缺糖缺氧再灌注性損傷后的凋亡具有明顯的抗凋亡作用。具體機制還有待于更多的實驗進行探索。

參考文獻：

[1] Mar Martinez-Vila E， Irimia P： Challenges of neuroprotection and neurorestoration in ischemic stroke treatment. Cerebrovasc Dis 2018;20：148-158.

[2] Jaffer H， Morris VB， Stewart D， Labhasetwar V： Advances in stroke therapy. Drug Deliv Transl Res 2019;1：409-419.

[3] Lu TH， Tseng TJ， Su CC， et al. Arsenic induces reactive oxygen species-caused neuronal cell apoptosis through JNK/ERK-mediated mitochondria-dependent and GRP 78/CHOP-regulated pathways[J]. Toxicol Lett， 2014，224（1）：130-140.