川崎病患兒外周血miR-145和心肌素的表達及其與冠狀動脈損害的關系

陳 建，李 剛

川崎病又名皮膚黏膜淋巴綜合征，是兒科常見的一種全身免疫系統中小血管炎性疾病，多發于5歲以下兒童，以發熱、皮疹、淋巴結腫大、手足硬性水腫為臨床表現，病理改變可涉及全身多器官系統，其中以冠狀動脈損害最為常見。研究表明，川崎病患兒冠狀動脈損傷發生率高達30%，一般以冠狀動脈擴張或冠狀動脈瘤為主，已成為導致患兒死亡的重要心血管并發癥[1]。目前臨床上對于川崎病患兒是否可能并發冠狀動脈損害尚無特異性預測指標，僅僅依靠醫生臨床經驗及部分明顯性癥狀出現后才能確診，治療難度大，因此，亟須尋找一種可特異性反映川崎病患兒并發冠狀動脈損害的生物學指標來對患兒進行早期預測，以加強監測，改善治療效果，降低患兒死亡率。微小核糖核酸-145(microRNA-145，miR-145)是在血管平滑肌細胞中表達較為豐富的一種microRNA，可作為血管平滑肌細胞由收縮表型轉化為分泌表型的一種重要標志物，通過多種機制參與心血管疾病發展過程[2]。心肌素基因最早克隆自小鼠心臟cDNA，屬核蛋白SAP結構域家族，可通過激活miR-145表達促進血管平滑肌細胞分化，參與受損血管修復過程[3]。以往臨床上對miR-145和心肌素的研究多集中于冠狀動脈粥樣硬化、心肌缺血或腫瘤等疾病，在川崎病患兒中研究較少。因此，本研究擬通過檢測川崎病患兒血清miR-145及心肌素水平，分析二者表達情況與川崎病患兒冠狀動脈損害的關系。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準 川崎病診斷標準：參照2002年日本川崎病研究委員會修訂的第5版診斷標準[4]，①持續發熱≥5 d；②雙側眼結膜充血；③出現楊梅舌，口腔咽部黏膜呈彌漫性充血；④出現皮疹、紅斑等皮膚性變化；⑤急性期患兒四肢出現硬性水腫，恢復期患兒皮膚移行處出現膜樣脫皮；⑥單側頸部出現直徑>1.5 cm的非化膿性淋巴結腫大。滿足以上任意5條即可確診為川崎病。合并冠狀動脈損害診斷標準[5]：采用超聲心動圖檢查冠狀動脈，若①冠狀動脈內膜回聲增強，冠狀動脈腔呈現明顯不規則；②某一段冠狀動脈內徑超過相鄰段1.5倍；③3歲以下患兒表現為冠狀動脈內徑超過2.5 mm，3～9歲患兒超過3 mm，9～14歲患兒超過3.5 mm。

納入標準：①符合上述標準確診為川崎病患兒；②年齡≤5歲患兒；③納入研究前未進行過影響本次研究結果的治療患兒；④患兒及監護人同意本次研究，并簽署知情同意書。排除標準：①合并血液系統疾病、自身免疫疾病患兒；②合并肝、腎等重要器官嚴重病變患兒；③依從性差患兒。

1.2 臨床資料 選取2015年5月—2018年10月眉山市婦幼保健院和西南醫科大學附屬醫院收治的川崎病患兒72例為研究對象，按照是否出現冠狀動脈損害分為無損害組和損害組。無損害組40例，男23例，女17例；年齡5～57(32.19±6.45)個月。損害組32例，男18例，女14例；年齡6～60(33.28±6.77)個月。另選同期在眉山市婦幼保健院體檢性別、年齡相仿的健康志愿者40名為對照組，男22名，女18名；年齡5～60(33.75±6.92)個月。3組研究對象在年齡、性別等基本資料方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床生化指標收集 采用全自動生化分析儀收集C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、白細胞計數(white blood cell，WBC)、紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、血小板計數(blood platelet，PLT)等常規臨床生化指標，對照組數據均于體檢當日獲得。

1.3.2 炎癥相關因子 抽取頸靜脈血，采用酶聯免疫吸附法檢測血清白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)、白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)水平，試劑盒均購自深圳科潤達生物工程有限公司。

1.3.3 血清miR-145水平 抽取頸靜脈血，采用熒光定量PCR技術測定血清miR-145表達水平，逆轉錄試劑盒購自北京博爾邁生物技術有限公司，并嚴格按照操作說明書進行逆轉錄。定量PCR條件首先是94 ℃預變性3 min，然后按照94 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 40 s的程序進行，反應共設置40個循環，以U6為內參，引物序列如下，miR-145正向引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，反向引物：5′-AGGTCCAGTTTTCCCAGG-3′，U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.4 血清心肌素水平 采集患兒入院后頸靜脈血，采用酶聯免疫吸附法檢測血清心肌素水平，試劑盒購自上海盈公生物技術有限公司。

2 結 果

2.1 3組臨床生化指標檢測結果比較 冠狀動脈損害組患兒血清CRP、WBC、PLT、ESR水平高于冠狀動脈無損害組和對照組(P<0.05)，且冠狀動脈無損害組高于對照組(P<0.05)。詳見表1。

組別例數CRP(mg/L)WBC(×109/L)PLT(×109/L)ESR(mm/h)對照組 402.51±0.57 15.79±3.18 222.54±40.87 11.38±2.06 無損害組409.74±2.86①28.19±5.62①310.12±61.53①27.94±5.22①損害組 3220.55±4.29①②37.83±7.24①②435.51±84.99①②52.73±10.49①②F值350.461147.689100.786358.074P 0.000 0.000 0.000 0.000

與對照組比較，①P<0.05；與無損害組比較，②P<0.05。

2.2 3組血清炎癥相關因子水平比較 冠狀動脈損害組血清IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α水平高于冠狀動脈無損害組和對照組(P<0.05)，且冠狀動脈無損害組高于對照組(P<0.05)。詳見表2。

組別例數IL-6IL-8IL-10TNF-α對照組 4023.59±4.46 10.37±1.96 9.77±1.85 11.46±2.35 無損害組4048.91±9.73①25.48±5.03①21.07±4.13①20.84±4.11①損害組3265.42±13.01①②38.14±7.52①②30.21±5.88①②29.78±5.63①②F值181.035262.289220.088176.289P 0.000 0.000 0.000 0.000

與對照組比較，①P<0.05；與無損害組比較，②P<0.05。

2.3 3組血清miR-145及心肌素水平比較 冠狀動脈損害組血清miR-145及心肌素水平低于冠狀動脈無損害組和對照組(P<0.05)，且冠狀動脈無損害組低于對照組(P<0.05)。詳見表3。

組別例數miR-145相對表達量心肌素(ng/L)對照組402.65±0.51267.45±51.28無損害組401.97±0.39①154.59±32.08①損害組321.08±0.22①②85.64±17.96①②F值135.903219.178P 0.000 0.000

與對照組比較，①P<0.05；與無損害組比較，②P<0.05。

2.4 相關性分析 miR-145在川崎病患兒血清中表達水平與心肌素水平呈正相關(P<0.01)，在冠狀動脈損害組中相關系數為0.847。詳見圖1。在冠狀動脈無損害組中相關系數為0.792。詳見圖2。

圖1 冠狀動脈損害組川崎病患兒血清中miR-145與心肌素的相關性分析

圖2 冠狀動脈無損害組川崎病患兒血清中miR-145與心肌素的相關性分析

2.5 Logistic回歸分析結果 以川崎病患兒是否并發冠狀動脈損害為應變量，以患兒年齡、血清CRP、WBC、PLT、ESR、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、miR-145及心肌素水平為自變量行Logistic回歸分析，結果顯示，低水平的血清miR-145及心肌素是川崎病患兒并發冠狀動脈損害的危險因素(P<0.05)。詳見表4。

表4 影響川崎病患兒并發冠狀動脈損害的Logistic回歸分析

3 討 論

川崎病是一種急性發熱出疹性疾病，病因復雜，具有明顯的季節性、地域性和年齡特點[6]。大量研究顯示，川崎病可能與感染引起的氣管炎癥性損傷、機體免疫失調有關[7]，自然界中存在川崎病感染源，人體一旦感染可引起體內T細胞異?；罨?，Th1/Th2細胞失衡，CD25、CD30等大量活化分子過度表達，產生大量炎性細胞因子，造成血管內皮和部分組織細胞損傷，導致血管局部浸潤，出現全身中小血管炎性損傷，進而引發川崎病。CRP是由肝細胞合成的一種急性時相反應蛋白，在病人體內出現急性炎癥時表達水平快速升高，炎癥水平下降時其含量隨之下降[8]。本研究結果顯示，冠狀動脈損害組患兒血清CRP、WBC、PLT、ESR水平高于冠狀動脈無損害組和對照組，且冠狀動脈無損害組高于對照組，提示川崎病可引起患兒血清CRP、WBC、PLT、ESR水平升高，且合并冠狀動脈損害病人升高程度大于無冠狀動脈損害患兒。川崎病患兒血液循環中含有部分免疫小復合物，可阻滯正常情況下網狀內皮系統對部分聚集或黏附血小板的清除作用，導致血小板水平升高，從而引起組織胺釋放量增加，造成免疫復合物沉積，產生血管內皮損傷[9]。ESR是指一定時間內紅細胞的下沉距離，可在有大量炎性介質和免疫球蛋白存在的高度活化免疫系統中高表達[10]。本研究對部分血清炎癥相關因子分析結果顯示，冠狀動脈損害組血清IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α水平高于冠狀動脈無損害組和對照組，且冠狀動脈無損害組高于對照組，提示IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α可能參與川崎病合并冠狀動脈損害的發生發展過程。IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α是由T細胞、單核巨噬細胞等分泌的具有生物學效應的促炎介質，可誘導內皮細胞黏附，促進血小板聚集，調控組織因子表達，改變血管內皮細胞結構，引起血管內皮損傷，導致冠狀動脈受到損害。

microRNA是具有高度保守性的內源非編碼單鏈小分子RNA，與目的基因的3′非翻譯區發生特異性結合，在基因轉錄后水平上參與調控，穩定存在于血清、血漿等組織體液中，在機體細胞增殖、凋亡及免疫炎癥反應方面起重要的作用[11]。miR-145是位于人類5q32染色體上的一種microRNA，與血管平滑肌分化狀態密切相關，其靶標基因KLF5可上調SM22α、SMα-MHC和SMα-actin等血管平滑肌表型分化標志基因轉錄水平，在多種心血管疾病發生發展過程中起關鍵調節作用[12]。心肌素定位于人類染色體17p11.2，含有807個氨基酸，是分化狀態下血管平滑肌細胞標志性基因的重要下游調控元件，可正向調控miR-145表達，負向調控KLF5表達[13]?？籽┰频萚14]研究顯示，血管平滑肌細胞受到損傷時，可引起血清miR-145及心肌素水平下降，KLF5水平升高，從而促進血管平滑肌去分化，導致血管炎性損傷。Jeffrey等[15]通過對小鼠胚胎研究顯示，miR-145和心肌素之間存在相互影響作用，一方面miR-145的3′非翻譯區可直接與心肌素結合，通過上調血清反應因子復合物和心肌素水平，增強自身表達，促進血管平滑肌分化，減輕血管內

膜損傷程度，緩解心血管疾??；另一方面，心肌素也可通過激活miR-145表達來參與血管損傷修復過程。本研究結果顯示，冠狀動脈損害組患兒血清miR-145及心肌素水平低于冠狀動脈無損害組和對照組，且冠狀動脈無損害組低于對照組，提示miR-145及心肌素在川崎病患兒血清中低表達，且在合并冠狀動脈損害組患兒血清中的表達水平低于冠狀動脈無損害組。相關性分析顯示，miR-145在川崎病患兒血清中表達水平與心肌素水平呈正相關，在冠狀動脈損害組中相關系數為0.847，在冠狀動脈無損害組中相關系數為0.792，提示miR-145和心肌素可能通過某種機制共同參與川崎病合并冠狀動脈損害的發生發展。進一步分析顯示，低水平的血清miR-145、心肌素是川崎病患兒并發冠狀動脈損害的危險因素，提示可通過檢測川崎病患兒血清miR-145、心肌素水平來預測冠狀動脈損害的發生。

綜上所述，miR-145、心肌素在川崎病合并冠狀動脈患兒血清中低表達，低水平的血清miR-145、心肌素是川崎病患兒并發冠狀動脈損害的危險因素。本研究不足之處在于未對血清miR-145、心肌素水平預測冠狀動脈損害的靈敏度及特異性進行進一步分析，因此，在后續研究中將會逐步涉及。