小麥病程相關基因TaSec14的克隆及功能研究

牛歡 馮靜云 黃建國 張超群 張露露 劉曉穎 王振英

（1. 天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2. 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

小麥（Triticum aestivumL.）是世界上廣泛種植的禾本科糧食作物之一，但各種病蟲害的發生嚴重影響了小麥的產量，其中由布氏白粉菌（Blumeriagraminisf. sp.tritici）引起的小麥白粉病是危害嚴重的病害之一［1-2］。

Sec14p是一種廣泛存在于真核生物中的磷脂酰肌醇轉運蛋白（Phosphatidylinositol transfer proteins，PITPs）［3］，最早在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中被發現［4］，主要參與磷脂代謝和形成高爾基體分泌囊泡等過程［5-6］。最近發現，Sec14基因家族在植物響應逆境脅迫中發揮了重要的作用，Wang等［7］在擬南芥中過表達玉米Sec14p基因發現，轉基因擬南芥的根長變短、種子萌發率下降，并且脯氨酸的積累減少，抗氧化酶活性下降，這一系列變化最終提高了轉基因擬南芥對低溫脅迫的耐受性。Kie?bowicz-Matuk等［8］在抗旱大麥中發現，HvSec14p蛋白能與大多數磷脂酰肌醇結合，且在滲透脅迫下轉錄水平明顯增加。認為該蛋白可能通過參與細胞內磷脂酰肌醇的合成，增強抗旱大麥細胞膜的滲透能力。毛花英等［9］在甘蔗中克隆了Sec14基因，發現在聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）、鹽、CaCl2和水楊酸（Salicylic acid，SA）脅迫下ScSec14基因表達均上調，推測ScSec14可能參與了Ca2+和SA介導的信號通路從而響應逆境脅迫。蘇世超等［10］發現TaSec14p-5基因在小麥孕穗期的不同組織中組成型表達，并受鹽、脫落酸（Abscisic acid，ABA）、干旱及低溫脅迫的誘導。有關Sec14基因參與植物與病原菌互作的研究僅在煙草（Nicotiana tabacumL.）中有過報道，Kiba等［11］發現煙草被青枯菌（Ralstonia solanacearum）侵染后，NbSec14基因的表達上調，而沉默NbSec14后煙草對青枯菌的抗性降低，推測該基因可能與植物防御反應有關。在隨后的研究中還發現，NbSEC14基因沉默植株中二酰甘油（Diacylglycerol，DAG）、磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）的含量下降，磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）、磷脂酶D（Phospholipase D，PLD）的活性降低；過表達NbSEC14植株的DAG、PA含量上升，PLC、PLD活性升高。認為NbSEC14蛋白可能通過參與磷脂代謝、調節磷脂酶活性，從而在煙草抗青枯菌的免疫反應中起重要作用［12］。目前，還未發現關于Sec14基因參與小麥與白粉菌互作過程的報道。

通過RNA-seq技術得到感病小麥品種京411中一段差異表達序列，根據該序列設計引物克隆了TaSec14基因。本研究利用生物信息學技術，分析TaSec14的基因結構和與其他物種Sec14的同源性。利用實時熒光定量PCR技術和VIGS技術分別分析TaSec14基因在不同抗性品種小麥接種白粉菌后的表達模式，以及降低該基因表達后感病小麥京411的抗病性變化，從而探究TaSec14基因在小麥與白粉菌互作過程中的作用，并為研究TaSec14基因功能提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

京411是半矮稈小麥品種，具有抗寒性強、分蘗力強、成穗率高等優點，是我國北部冬麥區高產廣適育種的骨干親本［13］，苗期對白粉菌侵染的表型為高感［14］。Brock是對白粉病具有強抗性的小麥品種，作為抗病遺傳資源從英國引進，可能攜帶Pm2基因［15-16］。本實驗室在前期研究發現，Brock的Pm2可能已經喪失了對白粉病病原菌的抗性，在Brock小麥的3BL上可能攜帶一個新的抗白粉病基因［17］。京 411×Brock抗白粉病近等基因系 BJ-1，該材料是以感病品種小麥京411為輪回親本，以抗病品種小麥Brock為抗病基因供體，通過雜交獲得F1代。之后再與感病品種小麥京411進行連續回交6代，每一代都在白粉菌脅迫下選取抗病植株，最后再自交1代后獲得［18］。所用菌種為白粉菌生理小種E09，由中國農業科學院植物保護研究所提供。病毒材料為大麥條紋花葉病毒（Barley Stripe Mosaic Virus，BSMV）。

實驗所用引物見表1，由金唯智生物科技有限公司天津分公司合成。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 小麥葉片cDNA和DNA的制備 根據Promega 公 司 Eastep?Super Total RNA Extraction Kit中的方法提取京411品種小麥葉片總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性，Nanodrop1000紫外分光光度計檢測RNA的濃度和質量。按照Promega公司M-MLV Reverse Transcriptase中體系以oligo（dT）18作為反轉錄引物，京411品種小麥總RNA為模板合成cDNA。使用天根公司Plant Genomic DNA Kit中的方法提取京411小麥基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳分析樣品完整性。

1.2.2TaSec14基因的克隆及序列分析 根據RNASeq結果設計引物SecCDS-F/R，以京411小麥cDNA為模板，擴增差異表達序列。體系為：5×PSGXL Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，SecCDS-F 0.5 μL，SecCDS-R 0.5 μL，cDNA 0.25 μL，Prime STAR GXL 0.5 μL，滅菌水 15.5 μL。反應程序為 ：94℃ 5 min ；35 個循環 ：98℃ 10 s，58℃ 15 s，68℃ 1 min 15 s；68℃ 7 min；4℃保存。回收目的基因并和pGEM-TEasy構建重組載體后送公司測序。將測序結果上傳至NCBI中的保守結構域數據庫（Conserved domain database，CDD）分析其結構域。將基因序列上傳至NCBI GeneBank進行Blastx比對，查找與其相似度高的基因。再利用DNAMAN軟件將該基因的氨基酸序列與其他物種氨基酸序列進行比對，通過MEGA軟件構建系統進化樹，分析其同源性。

根據cDNA序列設計DNA擴增引物SecFlth-F/R，以京411的DNA為模板進行擴增。體系為：5×PSGXL Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，SecFlth-F 0.5μL，SecFlth-R 0.5 μL，DNA 1 μL，Prime STAR GXL 0.5 μL，滅菌水 15.5 μL。反應程序為：94℃ 5 min；35個循環 ：98℃ 10 s，58℃ 15 s，68℃ 2 min ；68℃ 7 min；4℃保存。按照與cDNA相同的方式測得目的基因的DNA序列，并用IBS 1.0.2軟件繪制基因結構示意圖。

1.2.3TaSec14基因在白粉菌脅迫下的表達模式分析 京411、BJ-1和Brock幼苗長至一葉一心期時，采用抖佛法將新鮮的白粉菌孢子均勻接種于小麥第一葉表面。分別對接種不同時間點（0、2、4、8、12、24和48 h）的不同品種小麥第一葉進行取材，剪取葉尖1/3部位3 cm，放于滅菌且經液氮低溫處理過的2 mL EP管中，-80℃超低溫冰箱保存。按照1.2.1中的方法獲得小麥cDNA，并根據cDNA非保守區域序列設計引物SecQ-F/R，以小麥TaActin基因為內參，根據上海羅氏制藥有限公司Fast Start Universal SYBR Green Master（ROX）設計實時熒光定量PCR反應體系：SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 1 μL，SecQ-F 1 μL，SecQ-R 1 μL，無菌水 7 μL。每個樣品設置3個生物學重復。利用7500 Fast Real-Time PCR System進行擴增，程序為：50℃ 2 min；40 個循環 ：95℃ 10 min，95℃ 15 s，58℃ 30 s。反應完成后進行溶解曲線分析，以確定引物的特異性。將樣品擴增的Ct值進行匯總，采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量，將3個重復得到的相對表達量數據計算平均值作為最終結果，并用Origin 9軟件繪制TaSec14基因的相對表達量圖。

1.2.4TaSec14基因的VIGS分析 根據TaSec14基因非保守區序列設計特異性沉默引物 SecV-F/R，以感病小麥京411的cDNA為模板擴增沉默片段。使用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行分析，回收沉默片段后與BSMVγ∶載體骨架構建重組載體BSMVγ∶TaSec14。

提取含有病毒載體的質粒BSMVα、BSMVβ、BSMVγ∶GFP、BSMVγ∶PDS以及 BSMVγ∶TaSec14，經線性化、酚仿抽提純化后，參照普洛麥格公司RiboMAX TM Large Scale RNA Production System-T7試劑盒對BSMV病毒進行體外轉錄，獲得病毒RNA。配制摩擦接種工作液：混合BSMVα、BSMVβ、BSMVγ∶GFP各組分RNA作為BSMV∶GFP陽性對 照 組；混 合 BSMVα、BSMVβ、BSMVγ∶PDS各組分RNA作為BSMV∶PDS陽性對照組；混合BSMVα、BSMVβ、BSMVγ∶TaSec14各組分 RNA 作為BSMV∶TaSec14實驗組。等體積混合滅活的DEPC水和GKP Buffer作為空白對照組。待感病小麥京411長到第二葉完全展開時，將工作液以8 μL每份的劑量摩擦接種至葉片上。

1.2.5TaSec14基因沉默效率驗證 首先對沉默體系的有效性進行檢驗，由于PDS基因是高等植物合成類胡蘿卜素的關鍵基因，該基因的缺失將導致植株葉片白化，故對摩擦接種后BSMV∶PDS對照組葉片的白化情況進行觀察，驗證沉默體系的有效性。待GKP Buffer對照組、BSMV∶GFP對照組和BSMV∶TaSec14實驗組植株第三葉完全展開時，按照1.2.3中的方法接種白粉菌，并分別對接菌0 h和4 h各組植株的第三葉進行取材。按照1.2.3方法提取各樣品總RNA后反轉錄成cDNA，每個樣品進行3個生物學重復，利用實時熒光定量PCR技術和2-ΔΔCt法得到各組植株葉片TaSec14基因的表達量，將3個重復樣品得到的相對表達量求均值后計算TaSec14基因的沉默效率，計算方法為：

TaSec14基因的沉默效率=（1-BSMV∶TaSec14實驗組中TaSec14基因的表達量/GKP Buffer對照組中TaSec14基因的表達量）×100%

之后采用t檢驗法檢測實驗組與對照組的差異情況，將TaSec14基因的相對表達量和差異情況利用Origin 9軟件繪圖。

1.2.6 敲減TaSec14基因后的白粉菌細胞形態學觀察和統計分析 按照1.2.3取材方法，對接種白粉菌2 d、3 d和7 d的GKP Buffer對照組、BSMV∶GFP對照組和BSMV∶TaSec14實驗組植株第三葉進行取材。經脫色固定、考馬斯亮藍R-250染色后，用共聚焦顯微鏡觀察葉片上白粉菌孢子的發育情況。統計接種白粉菌24 h后BSMV∶GFP對照組和BSMV∶TaSec14實驗組植株葉片上的白粉菌分生孢子、喙型附著胞和畸形附著胞（分瓣型和纖細型）數目，每個樣品的白粉菌數目統計3次求平均值作為樣本值。根據公式計算白粉菌的成功侵染率和畸形比率，分析基因沉默后小麥對白粉菌抗性的變化。

計算方法為：

白粉菌孢子成功侵染率=喙型附著胞/（喙型附著胞+畸形附著胞+分生孢子）×100%；

白粉菌畸形孢比率=畸形附著胞/（喙型附著胞+畸形孢+分生孢子）×100%。

2 結果

2.1 TaSec14基因的生物信息學分析

克隆得到該基因的cDNA全長序列（1 564 bp）和DNA全長序列（2 186 bp），利用APE軟件預測其開放閱讀框為1 212 bp，編碼403個氨基酸，如圖1所示。利用IBS 1.0.2軟件繪制基因結構示意圖，該目的基因含有兩個主要的結構域，即結合脂質的CRAL_TRIO_N結構域和具有磷脂酰肌醇轉運功能的SEC14結構域（圖2-A），該基因包括5個外顯子和4和內含子，呈間隔排布（圖2-B）。

Blastx比對結果顯示該基因與二穗短柄草（Brachypodium distachyon，Bd）、 玉米（Zea mays，Zm）、水稻（Oryza sativa，Os）、黍（Panicum hallii，Ph）、 棗（Ziziphus jujuba，Zj）、 蓖麻（Ricinus communis，Rc）和可可（Theobroma cacao，Tc）中Sec14蛋白家族的相似性較高，分別為80.45%、76.75%、72.38%、68.67%、67.31%、65.80% 和61.96%。利用DNAMAN軟件將該基因的氨基酸序列與其他7個物種氨基酸序列進行比對分析，結果如圖3所示，幾個物種Sec14結構域部分的相似性高，說明其具有較高的保守性。系統進化樹分析表明該基因編碼的蛋白與多個物種中的SEC14蛋白有親緣關系，且與二穗短柄草PITP3蛋白（XP_010236107.1）的親緣關系最為接近（圖4），說明其屬于Sec14蛋白家族，故將該基因命名為TaSec14。

2.2 白粉菌脅迫下TaSec14基因的表達模式分析

以小麥TaActin作為內參基因，分析接種白粉菌后3個小麥品種中TaSec14基因的表達模式（圖5）。發現在感病小麥京411中TaSec14基因的本底表達量最高，接種白粉菌之后表達量上升，在8 h達到一個高峰，之后開始下降，24 h再次達到高峰，之后再次下降。在抗病小麥BJ-1中，TaSec14表達量在接種白粉菌后開始上升，4 h達到高峰，之后開始下降，12 h后再次升高。在抗病小麥Brock中，TaSec14的表達量在接種白粉菌后先上升，8 h達到峰值，之后開始下降，在24 h后又有小幅上升。在感病小麥京411及其近等基因系BJ-1中，TaSec14基因的表達量一直高于抗病小麥Brock，并且在近等基因系BJ-1中的表達趨勢也和輪回親本京411相似。

2.3 TaSec14基因沉默體系構建

利用特異性沉默引物SecV-F/R擴增TaSec14基因片段，然后與BSMVγ∶載體骨架構建BSMVγ∶TaSec14重組載體。待各組植株第三葉完全展開后，對其進行摩擦接種。圖6是各組葉片的表型觀察結果，BSMV∶PDS對照組的葉片白化明顯，說明PDS基因被有效沉默，體系構建成功。

實時熒光定量PCR檢測各組TaSec14基因轉錄水平變化，結果如圖7所示，發現與對照組相比，接種病毒RNA后，實驗組TaSec14的表達水平在0 h時的沉默效率為85%，在4 h時的沉默效率為90.5%，并且t檢驗結果表明實驗組中TaSec14基因的表達量與對照組的差異均達到極顯著水平，說明小麥內源基因TaSec14的表達被有效抑制。

圖1 TaSec14基因序列信息

圖2 TaSec14基因結構示意圖

2.4 TaSec14基因敲減后影響白粉菌孢子發育

圖3 TaSec14同源序列比對結果

圖4 TaSec14系統進化樹分析結果

圖5 TaSec14基因在白粉菌侵染下的表達模式分析

對基因敲減后感病小麥京411接種新鮮的白粉菌孢子，觀察接種2 d、3 d和7 d后各組小麥植株的第3葉，統計葉片上白粉菌孢子的生長發育情況，圖8是接種白粉菌孢子不同時間后細胞生長發育情況。接種白粉菌2 d后，BSMV∶TaSec14實驗組葉片上多數為未侵染成功的畸形附著孢，僅可以看到少量的喙型附著胞（圖8-C），而在GKP Buffer對照組（圖8-A）和BSMV∶GFP對照組中，已經出現了初級菌絲（圖8-B）；接種白粉菌3 d后，BSMV∶TaSec14實驗組中才出現初級菌絲（圖8-F），而在另兩個對照組中菌絲已經伸長，個別視野下還發現了念珠狀的孢子（圖8-D-E）；接種白粉菌7 d后，兩個對照組中均出現了大量的念珠狀孢子和遍布視野的次級菌絲（圖8-G、H），而這時BSMV∶TaSec14實驗組才開始有次級菌絲形成，沒有觀察到念珠狀孢子（圖8-I）。

圖6 TaSec14基因沉默后各組植株葉片的表型觀察結果

圖7 TaSec14基因沉默效率驗證

對每個樣品葉片上白粉菌孢子數目進行統計3次，求平均值作為樣本值。根據1.2.6中公式計算接種白粉菌24 h之后GKP Buffer對照組和BSMV∶TaSec14實驗組上白粉菌孢子的成功侵染率和畸形率，結果如圖9所示。BSMV∶TaSec14實驗組白粉菌的成功侵染率為35.92%，略低于GKP Buffer對照組的39.31%，白粉菌孢子的畸形率為11.27%明顯高于對照組的4.05%，并且BSMV∶TaSec14實驗組中白粉菌孢子的侵染率和畸形率與GKP Buffer對照組相比，差異均達到了顯著。以上結果表明，降低TaSec14基因的表達導致感病小麥京411對白粉菌抗性的增加。

圖8 白粉菌脅迫下各實驗組的白粉菌細胞形態學觀察

圖9 白粉菌細胞形態學統計

3 討論

3.1 TaSec14屬于磷脂酰肌醇轉運蛋白

Sec14結構域是一種高度保守且古老的脂質結合結構域，由酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sec14p進化而來，在亞細胞器和細胞運輸中執行復雜的調節功能［19］。Sec14基因家族編碼的蛋白參與植物非生物脅迫信號轉導［20］、脂類的運輸和代謝［21］、磷脂酶C調節的信號轉導等生理過程［22］。本研究克隆了一個在感病小麥京411中特異表達的TaSec14基因，含有典型的SEC14保守結構域，屬于磷脂酰肌醇轉運蛋白家族的成員。

3.2 敲減TaSec14基因改變京411對白粉菌的敏感性

VIGS是一種基于RNAi的對植物特定內源基因進行沉默實驗的技術［23］。由于植物體內存在能識別外源RNA并將其降解的免疫機制［24-25］，該技術利用該免疫機制，向植物體內轉化人工改造的病毒載體，完成對基因的沉默。利用VIGS技術敲減京411中的TaSec14基因后，發現接種白粉菌24 h后BSMV∶TaSec14實驗組的白粉菌孢子成功侵染率低于GKP Buffer對照組，畸形率高于對照組。表明抑制TaSec14基因的表達能一定程度上提高感病小麥京411對白粉菌的抗性。

3.3 TaSec14基因在小麥與白粉菌互作中起到調控作用

本研究克隆的TaSec14基因屬于Sec14基因家族，在接種白粉菌后，TaSec14在感病小麥京411及其近等基因系BJ-1中的表達量一直高于抗病小麥Brock，降低京411中的TaSec14基因表達后，BSMV∶TaSec14實驗組白粉菌的成功侵染率低于GKP Buffer對照組，并且畸形率明顯高于對照組，即降低內源TaSec14基因的表達能在一定程度上增加感病小麥京411抵御白粉菌侵染的能力。因此推測，TaSec14基因可能在小麥與白粉菌互作過程中起到一定的作用。Sec14蛋白家族可以介導磷脂酰肌醇的代謝并參與二酰甘油-蛋白激酶C（Diacylglycerol-Protein kinase C，DAG-PKC）途徑［26］。在最新的一項研究中發現［27］，稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的附著胞內存在一個組氨酸-天冬氨酸激酶Sln1膨壓感受器，當Sln1感受到閾值范圍內的膨壓后，能通過PKC依賴性的途徑發揮作用，磷酸化NADPH氧化酶或調控蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）途徑，從而共同調節附著胞膨壓和入侵栓的形成，參與水稻與稻瘟病菌的互作過程。由此發現，Sec14與Sln1都介導了PKC途徑，參與了磷脂酰肌醇信號通路，且最終都影響了植物與病原菌的互作過程。我們推測，TaSec14蛋白也有可能通過PKC途徑影響其他多元醇的合成，從而參與小麥與白粉病互作過程。本實驗對TaSec14基因功能的分析可為Sec14基因家族的研究提供新的依據。

4 結論

本研究克隆得到了普通小麥中的TaSec14基因，該基因含有典型的SEC14家族保守結構域。接種白粉菌后，感病小麥京411及其近等基因系BJ-1中TaSec14基因的表達量一直高于抗病親本Brock，且在BJ-1中的表達趨勢與輪回親本京411趨同。通過VIGS技術敲減京411中的TaSec14基因發現，降低京411內源TaSec14基因的表達能在一定程度上增加其對白粉菌的抗性。推測TaSec14基因可能在小麥與白粉菌互作過程起到了調控作用。