牦牛CSRP3基因的克隆及組織表達分析

白佳靈 王會 柴志欣 王吉坤 王嘉博 武志娟信金偉 鐘金城 陳智華 姬秋梅

（1. 西南民族大學 青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省 教育部重點實驗室，成都 610041；2. 西南民族大學 青藏高原研究院，成都 610041；3. 省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室，拉薩 850000）

富含半胱氨酸蛋白（Cysteine and glycine-rich proteins，CRPs）基因家族是LIM結構域蛋白質超家族的一個分支，其特點是富含半胱氨酸和甘氨酸，包括CSRP1、CSRP2、CSRP3和TLP四個基因，CSRP3基因編碼的CRP3蛋白，又稱MLP蛋白（Muscle LIM protein）或CLP蛋白（Cardiac LIM protein），主要在橫紋肌組織中表達［1］。CSRP3基因最早于大鼠的組織中獲得，經研究發現人和大鼠的CSRP3基因均含6個外顯子和5個內含子，起始密碼子位于第二外顯子，編碼194個氨基酸，主要是在心肌和骨骼肌中表達，且其表達與肌分化過程一致，是一個肌發生的正調節因子［2-4］。越來越多的研究表明，CRP3在肌源性分化和肌細胞結構中發揮重要作用。CRP3蛋白可通過多種方式調控肌肉發育和肌肉細胞結構維持，同時也可作為機械傳感器蛋白，與許多細胞骨架蛋白相互作用，參與基于肌動蛋白的細胞骨架組裝［5-7］；或通過其 LIM結構域在自噬過程中與LC3（微管相關蛋白1輕鏈3）相互作用，促進細胞自噬［8］；或與心肌肌球蛋白MyBP-C結合形成CRP3/MyBP-C復合物，參與肌纖維形成過程，并通過調節肌動蛋白ATP酶活性，在成肌細胞分化中發揮重要作用［9］。

研究發現CSRP3基因不僅對人類疾病有一定影響，對畜禽肉質及其生長性能方面也有重要影響。已有研究表明，CSRP3基因突變會導致人肥厚性心肌病［10］。敲除小鼠CSRP3基因也會導致心肌肥大和心衰［6］。CSRP3基因缺陷小鼠的骨骼肌的肌小節與肌纖維長度都比正常小鼠短，表明CRP3在維護正常的肌肉結構和功能中起重要作用［3］。對豬CSRP3基因進行克隆及鑒定表明CSRP3基因是影響豬肉品質的潛在功能候選基因［11］。干擾CSRP3 mRNA的表達會抑制雞的骨骼肌衛星細胞向肌管分化，表明CSRP3可能會通過促進雞骨骼肌衛星細胞的分化從而促進肌肉生長［12］。對秦川牛CSRP3基因進行SNP分析發現，群體中某些組合基因型與生長和胴體性狀顯著或極顯著相關，證明CSRP3作為一種標記基因在提高生長性能和胴體性狀方面有著巨大潛力［13］。研究發現CSRP3在小尾寒羊心臟組織中的表達量顯著高于杜泊羊，而在肌肉（背長肌和股二頭肌）組織中則相反［1］。

牦牛（Bos grunniens）是以我國青藏高原為起源地的大型反芻動物，也是“世界屋脊”著名的景觀牛種，素有“高原之舟”的美稱，是一個極其難得的、寶貴的基因庫［14-15］。牦牛肉品質好、口感好，是無污染的綠色食品，符合高蛋白、低脂肪的現代人健康飲食要求［16］，研究肌肉發育調控的相關基因對提高牦牛肉品質具有重要意義，已有研究［1，11-13］發現CSRP3基因參與調節肌肉發育過程，對畜禽生長性能和肉品質具有重要影響，而關于牦牛CSRP3基因的研究尚未見報道。故本實驗通過對牦牛CSRP3基因進行克隆及組織表達譜分析，以期為后續提高牦牛肉品質的研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗樣品采集于西藏自治區昌都市類烏齊縣，選取3頭0.5歲健康類烏齊牦牛，分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、臀大肌和臀脂，用DEPC水清洗干凈后，包裹于錫箔紙中并做好標記，迅速置于液氮中保存備用。

主要試劑：Taq DNA聚合酶、dNTPs購自博邁德生物公司；RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen公司；RNA反轉錄試劑盒（PrimeScriptTMRTReagent Kit with gDNA Eraser［Perfect Real Time］）、pGEM-T Vector cloning kit、DH5α感受態細胞、2 000 bp DNA Marker、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ均購自 TaKaRa 公司；瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及反轉錄 使用TRIzol法提取組織總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度，紫外分光光度計檢測RNA濃度及OD260nm/280nm值。利用RNA反轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA，存于-20℃冰箱備用。

1.2.2 牦牛CSRP3基因的克隆 根據GenBank中野牦牛CSRP3mRNA序列（XM_005900673.2），內參基因GAPDH（XM_014482068），利用Primer Premier 5軟件和NCBI Primer-BLAST在線軟件設計引物擴增CSRP3基因CDS區，再用克隆所得CSRP3基因序列設計實時熒光定量PCR引物（表1），引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

PCR擴增體系（總體積為25 μL）：上下游引物各 1 μL、cDNA 模 板 1 μL、ddH2O 9.5 μL、2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min，94℃變性 30 s，65℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，循環35次，72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行膠回收。

將純化回收得到的PCR產物連接到pGEM-T載體，并置于16℃恒溫的金屬浴中過夜連接。將連接產物轉化至DH5α感受態細胞中，篩選出陽性重組質粒，進行菌液PCR鑒定，并將篩選出來的菌液送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。

表1 牦牛CSRP3基因引物序列信息

1.2.3 組織表達差異分析 根據測序得到的序列設計實時熒光定量PCR引物，檢測CSRP3基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、臀達肌和臀脂組織的表達量。反應體系（10 μL）：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 5 μL、上下游引物各0.4 μL、無菌去離子水3.2 μL、模板cDNA 1 μL。反應程序：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，55℃退火30 s，共39個循環。其中每個樣本設置3個生物學重復3個技術重復，獲得每個樣品的Ct值后，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量，GAPDH作為內參基因對樣本定量結果進行處理。利用SPSS 20.0軟件對CSRP3基因在不同組織器官中的差異進行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著。

1.2.4 生物信息學分析 對牦牛CSRP3基因進行生物信息學分析，利用DNAStar中的MegAlign軟件對牦牛與其他12個物種的CSRP3基因CDS區序列做同源性分析，使用MEGA 7.0軟件構建系統進化樹，其他所用到的在線軟件如表2所示。

表2 生物信息學分析在線軟件網址

2 結果

2.1 牦牛CSRP3基因CDS區擴增及克隆測序

CSRP3基因PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得與預期牦牛CSRP3基因片段大小一致的單一清晰條帶，大小為673 bp（圖1），測序驗證后得到牦牛CSRP3基因CDS區大小為585 bp，編碼194個氨基酸殘基，相關序列信息已提交NCBI，登錄號為MN695918。

圖1 牦牛CSRP3基因PCR擴增結果

2.2 牦牛CSRP3基因序列相似性及系統進化樹分析

利用MegAlign軟件將克隆得到的牦牛CSRP3基因序列與家貓、斑馬魚、褐家鼠、黃牛、家雞、獼猴、黑猩猩、野豬、家犬、綿羊、熱帶爪蟾、蘇門答臘猩猩的該基因序列進行相似性比對，其中牦牛與黃牛的序列相似性高達100%，與斑馬魚的序列相似性為75.0%（表3）。利用MEGA 7.0 軟件采用NJ聚類法構建牦牛CSRP3基因系統進化樹（圖2），結果顯示牦牛與黃牛的親緣性最近；其次是綿羊；而與斑馬魚和熱帶爪蟾等較低等脊椎動物相距最遠。

2.3 CRP3蛋白的理化性質預測

利用在線軟件ExPASy中的ProtParam程序預測CRP3蛋白的理化性質，結果表明：該蛋白的分子式為C903H1403N263O275S19，由2 863個原子組成，分子質量為20 952.81，氨基酸總數為194，含量最多的是甘氨酸（13.4%）；其次是賴氨酸和半胱氨酸（10.3%和8.2%）；帶負電荷的殘基總數（Asp + Glu）為17，帶正電荷的殘基總數（Arg + Lys）為27，說明該蛋白帶正電荷；總平均親水性（GRAVY）為-0.561，為親水性蛋白；理論等電點為8.89，為偏堿性蛋白；摩爾消光系數為23 920，在哺乳動物網織紅細胞內的半衰期為30 h，不穩定指數為40.16，脂肪指數為43.81，根據Guruprasad方法表明CRP3為不穩定蛋白。

利用在線軟件ExPASy中的ProtScale程序預測CRP3蛋白的親水性/疏水性（圖3），147位點處有最大值為1.222，97位點處有最小值為-2.256，故CRP3蛋白變現為親水性，與理化性質預測的結果一致。

表3 牦牛與其它12個物種CSRP3基因序列相似性比對

圖2 NJ法構建的牦牛CSRP3基因系統進化樹

2.4 CRP3蛋白跨膜結構預測與信號肽分析

通過在線軟件ExPASy 中TMpred程序預測蛋白跨膜結構發現，CRP3蛋白無跨膜結構（圖4），不屬于跨膜蛋白。利用在線軟件SignalP 4.1進行蛋白質信號肽分析，發現無信號肽，說明CRP3蛋白不屬于分泌蛋白。

圖3 牦牛CRP3蛋白的親水性/疏水性分析

圖4 牦牛CRP3蛋白跨膜結構預測結果

2.5 CRP3蛋白磷酸化位點和糖基化位點預測

通過在線軟件NetPhos 3.1 Server，對CRP3蛋白序列進行磷酸化位點預測，結果（圖5）顯示在牦牛CSRP3基因編碼的氨基酸中有12個絲氨酸（S）磷酸化位點、6個蘇氨酸（T）磷酸化位點、4個酪氨酸（Y）磷酸化位點。利用NetNGlyc 1.0 對其進行糖基化位點預測，結果（圖6）顯示CRP3有2個N-糖基化位點（Asn107和Asn158），7個O-糖基化位點（Thr95、Thr101、Thr103、Thr104、Thr105、Thr106和Thr109）。

圖5 牦牛CRP3蛋白磷酸化位點預測結果

圖6 牦牛CRP3蛋白N-糖基化位點預測結果

2.6 CRP3蛋白保守結構域預測及亞細胞定位分析

利 用NCBI中 的Conserved Domain Database（CDD）數據庫對CRP3蛋白的保守結構域進行預測，結果（圖7）顯示該蛋白為LIM蛋白超家族成員，在第9-61位之間和第119-171位之間存在兩個LIM結構域，LIM結構域存在于多個發育途徑的關鍵調控因子中，兩個結構域均含有8個Zn2+結合位點。

利用在線軟件PSORT II Prediction分析牦牛CRP3蛋白的亞細胞定位發現，該蛋白在細胞核內分布最多（78.3%）；其次為細胞質（17.4%），線粒體中也有少量分布（4.3%）。

圖7 牦牛CRP3蛋白保守結構域預測結果

2.7 CRP3蛋白的高級結構預測

使用在線軟件ExPASy 中的SOPMA程序預測牦牛CRP3的二級結構，分析結果顯示，該蛋白以無規則卷曲為主，其中α-螺旋18個占總鏈的9.28%，延伸鏈28個占總鏈的14.43%，β-轉角10個占總鏈的5.15%，無規則卷曲138個占總鏈的71.13%（圖 8）。

圖8 牦牛CRP3 蛋白二級結構預測結果

利用在線軟件SWISS-MODEL對牦牛CRP3蛋白進行同源模建，預測其三級結構模型，其最佳模型是1b8t.1.A（圖9），序列一致性為67.43%；另一模型是2xjy.1.A，序列一致性為21.43%。該蛋白的三級結構表明，他們組成的多肽鏈有兩個高度相似的LIM結構域。

圖9 牦牛CRP3蛋白三級結構預測結果

2.8 牦牛CSRP3基因組織表達分析

通過實時熒光定量PCR檢測CSRP3基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、臀大肌和臀脂組織的表達量，并用SPSS 20.0軟件對其進行單因素方差分析。結果顯示，CSRP3基因在心臟表達量最高，并極顯著高于其他組織（P<0.01）；其次是臀大肌，在肝臟中的表達量最低（圖10）。

3 討論

研究表明CSRP3基因能夠參與調節肌肉發育，其編碼的CRP3蛋白可以通過蛋白質與蛋白質相互作用在肌肉發育過程中起重要調控作用。研究發現CSRP3基因在豬［11］、綿羊［1］、黃牛［13］、雞［12］等畜禽的肌肉發育過程中發揮著重要作用，說明該基因對畜禽生長性能和產肉品質具有重要影響。但關于牦牛CSRP3基因的相關研究尚未見報道，而被譽為“高原之舟”的牦牛，其肉質在很大程度上能決定其價值，因此對牦牛CSRP3基因的研究具有重要意義。本研究成功克隆了CSRP3基因的CDS區序列并對其進行了生物信息學分析，通過熒光定量PCR檢測其在牦牛不同組織中的表達量。

圖10 牦牛CSRP3基因的mRNA的組織表達分析

對克隆得到的牦牛CSRP3基因序列進行分析，發現該基因CDS區序列長585 bp，編碼194個氨基酸。甘氨酸具有獨特的甜味，是形成肉品香味所必需的前體氨基酸，與肉質的鮮味有直接的關系，同一種食物鮮味氨基酸含量越高，滋味就越好［17］。賴氨酸作為必需氨基酸可以合成骨骼肌等多種蛋白，抑制部分肌纖維蛋白質降解，賴氨酸殘基是骨膠原交聯的主要構成物質，羥賴氨酸參與膠原蛋白的糖基化修飾，而膠原蛋白和鈣磷等礦物質是構成骨骼的主要成分，因此賴氨酸對骨骼代謝有重要影響［18］。半胱氨酸可以通過促進谷胱甘肽的合成來提高反芻動物的生長性能［19］。本研究顯示牦牛CRP3蛋白甘氨酸、賴氨酸和半胱氨酸的含量分別為13.4%、10.3%和8.2%，表明牦牛CSRP3基因對肌肉發育過程有一定調控作用并可能會影響其肉質和生長性能。帶負電荷的殘基總數（Asp + Glu）小于帶正電荷的殘基總數（Arg + Lys），故CSRP3基因編碼的蛋白質帶正電荷，該蛋白理論等電點為8.89，是偏堿性蛋白，其不穩定指數為40.16，是不穩定蛋白，對其親水性/疏水性進行預測發現該蛋白為親水性蛋白。預測結果顯示，CSRP3基因編碼的蛋白含有22個磷酸化位點，2個N-糖基化位點和7個O-糖基化位點。磷酸化是一種廣泛存在的重要的翻譯后蛋白質修飾作用，蛋白質磷酸化作用為調控蛋白質合成和代謝，分子識別和信號傳導，肌肉收縮等，糖基化屬于蛋白修飾，其作用是維持蛋白的空間構象，調節細胞表面受體的表達和功能，影響細胞生長和凋亡［20］。牦牛CRP3蛋白主要分布在細胞核中，線粒體和細胞質中也有少量分布。有關研究表明［21］，在細胞核中，CRP3是肌生成的正向調控因子，促進肌源性分化，CRP3過表達導致肌管分化增強，這是由于CRP3與MyoD、肌原蛋白、MRF4等肌分化轉錄因子直接相關；在細胞質中突變或缺乏CRP3會造成心臟細胞結構的嚴重破壞和肌纖維的紊亂，這種細胞骨架效應主要是通過其在z盤上的定位及其與不同z盤組件的相互作用介導的，說明CRP3蛋白在細胞核和細胞質中均可發揮作用。

CSRP3基因所屬的CRPs基因家族是LIM結構域蛋白質超家族的一個分支，該家族成員含有的典型結構域為LIM結構域，對CRP3蛋白結構域的預測結果顯示，其含有兩個LIM結構域，與CRP3蛋白的三級結構預測結果一致。LIM結構域廣泛存在于真核生物蛋白中，LIM由兩個不同的鋅指亞結構域組成，其結構高度保守，主要與蛋白質結合，可以在細胞核和細胞質中介導蛋白質-蛋白質相互作用，在信號轉導、細胞分化和細胞骨架的形成中發揮重要作用。含有LIM結構域的CRP蛋白亞家族與細胞骨架相關，在黏附斑塊和肌動蛋白微絲組織中具有作用，參與細胞骨架的重建和平滑肌的分化［22］。

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，牦牛CSRP3基因主要在心臟中表達；其次是臀大肌。與He［13］發現CSRP3基因在黃牛肌肉中表達量最高；其次是心臟的研究結果存在差異。這種差異表達可能是因為CSRP3基因在牦牛和黃牛肌肉細胞生長和分化中的調控機制存在差異；也可能是所選取的發育階段不同造成的；另外也可能與牦牛生活在高海拔低氧地區，心臟在高原低氧適應中扮演重要角色有關［23］，具體原因需要進一步研究。CRP3蛋白在心肌細胞和慢收縮骨骼肌細胞中均有表達［24］，研究發現CRP3是一種參與心肌細胞結構的蛋白質，siRNA沉默CSRP3基因之后，可使由苯腎上腺素誘導的心肌細胞肥大和CSRP3過表達發生逆轉，說明CSRP3基因在心臟保護方面能夠發揮重要作用［10］。CRP3蛋白在大鼠慢肌中組成性的表達，在快肌中低表達，并在快型骨骼肌蛋白轉換為慢型骨骼肌蛋白過程中上調表達［25］。Vafiadaki等［26］發現了 CRP3 蛋白的剪接變異體（CRP3-b），CRP3-b定位于分化橫紋肌的肌節，可直接與z盤成分結合，作為肌管形成的負調節因子參與肌發生過程。綜上所述，前人研究結果均表明CSRP3基因是心臟和骨骼肌功能的主要調節因子。本研究結果表明CRP3在牦牛臀大肌中具有較高表達量，推測該基因在牦牛肉品質的調控中發揮著重要作用。

4 結論

本研究成功克隆了牦牛CSRP3基因，得到長為585 bp的CDS區序列，編碼194個氨基酸殘基；生物信息學分析結果顯示，CRP3蛋白含有兩個LIM結構域，主要分布在細胞核中，可正向調控肌肉發育過程；實時熒光定量PCR結果顯示牦牛CSRP3基因在臀大肌中具有較高表達量。以上研究結果為牦牛CSRP3基因在牦牛肉品質方面的調控機制研究提供了基礎數據。