DNA/銀納米簇介導的功能核酸生物傳感器研究進展

楊敏 李舒婷 楊文平 李相陽 許文濤

（1. 北京農學院食品科學與工程學院，北京 100083；2. 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心 中國農業大學，北京 100083）

貴金屬納米團簇是由 Au、Ag和Pt 等貴金屬元素組成的分子聚集體，一般由幾個到幾十個原子組成。金屬納米團簇的理化性質對其物理尺寸有強烈的依賴性，當尺寸接近電子的費米波長（金和銀約0.5 nm），連續的密度態分裂成類似于分子的不連續的能級，與激發光相互作用時電子能夠在能級之間轉換，進而能發出強烈的熒光［1］，顯現出獨特的電學和光學性能［2］。其中，以DNA為模板的銀納米簇（Ag NCs）由于其高熒光量子產率（> 50%），良好的光穩定性，低毒性，生物相容性，易合成等優點而引起了廣泛關注［3］。基于此，本文對DNA / Ag NCs在生物傳感器及其應用方面的研究展開綜述，并著重介紹了其在細胞成像及抑菌方面的應用，最后總結了DNA / Ag NCs生物傳感器目前存在的不足和未來發展的趨勢，以期為研究者提供借鑒。

1 DNA/銀納米簇的制備及基本性質

1.1 DNA/銀納米簇的制備方法

DNA，特別是胞嘧啶堿基C與銀離子之間有強烈的親和性［4］，有證據表明迄今為止最成功的AgNCs就是用 DNA 為模板合成的，這種強烈親和性使得銀離子能夠維持雙鏈DNA的胞嘧啶之間C-C的錯配［5］。并且該方法制備條件溫和，制備的銀納米簇熒光性質穩定，生物相容性好，這些優點使得DNA穩定的銀納米簇的研究最為廣泛。

Zheng等［6］首次報道了用DNA為模板合成熒光銀納米簇，以含有12個堿基5'-AGGTCGCCGCCC-3'的DNA序列為模板，磷酸緩沖液為反應體系的緩沖液，NaBH4作為還原劑，在冰浴條件下合成了熒光銀納米簇，制備出的熒光銀納米簇穩定性好、溶于水、顆粒均勻。該Ag NCs在400 nm-550 nm有強的紫外吸收峰，在630 nm左右有熒光發射，質譜數據顯示所合成的Ag NCs只有1-4個Ag原子。后續的多次研究又強調了堿基種類、堿基序列以及 DNA的二級結構對合成DNA穩定的Ag NCs的關鍵作用［7-10］。隨后 O’Neill等［11］報道了用發卡狀 DNA（環上含 3-12個C）合成發熒光的Ag NCs，結果表明，環上C的數量可以調節所得Ag NCs的穩定性和熒光。因此，很多用于合成 DNA / Ag NCs 的模板都是富含胞嘧啶的單鏈DNA（ssDNA）或者是包含一段C環的發夾結構 DNA 和雙鏈DNA（dsDNA）。之后，Huang等［12］發現含錯配堿基對的雙鏈DNA 也被用于位點特異性的Ag NCs的合成，分子規模的Ag NCs位于錯配堿基對附近，而整體DNA還保持完整結構。

1.2 DNA/銀納米簇的表征

由于合成Ag NCs的DNA寡核苷酸的單分散性，使用電噴霧質譜（Electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）可以精確地確定納米團簇的化學計量學［13］。紫外-可見吸收光譜可以用來測定Ag NCs的最大吸收波長；熒光光譜可通過熒光分光光度計來獲得，從而獲得Ag NCs的熒光發射情況；Ag NCs的形貌和大小可借助透射電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM）來觀察和測量［14］。紫外可見光譜和圓二色光譜均可用來探討Ag NCs的結構變化及其熒光變化機制［15］。

2 多色DNA/銀納米簇的調控機制

Ag NCs周圍的配體/堿基環境是決定熒光發射顏色的重要因素，成核序列不同以及靠近Ag NCs的序列（增強子序列）不一樣，Ag NCs產生的熒光都可能會不一樣。目前DNA / AgNCs的熒光發射有四種主要的顏色，分別為紅、黃、藍、綠，如圖1所示。此外還有近紅外發射光。據報道，DNA / AgNCs由一個由Ag+離子包圍的核心/群中性Ag原子組成。中性原子的數目決定了原子團簇的發射波長，而Ag+離子將核心和DNA堿基“黏合”在一起［16-17］。Copp等［18］先前證明綠色和紅色發射往往分別與4個和6個中性核心銀原子有關。此后，該團隊又基于質譜分析，發現DNA / Ag NCs的紅色發射極含有6個中性的Ag原子和8個Ag+離子，綠色發射極含有4個中性的Ag原子。這意味著兩個Ag原子從原始紅色發射極的核心氧化成Ag+，從而導致熒光顏色的轉變［19］。

圖1 DNA/銀納米簇4種主要的熒光顏色

Dickson課題組［20］以不同的DNA序列為模板合成的具有不同顏色的熒光發射的熒光銀納米簇光譜，如表1所示，這些銀納米簇模板都以C12為基礎，通過變動中間部分的堿基類型和順序，合成的熒光銀納米簇的熒光發射光譜從可見光區域跨越到近紅外區域。

表1 五種不同單鏈DNA序列為模板穩定的銀納米簇的發射光

Sengupta等［21］小組利用3種不同序列的DNA（dT12、dT4C4T4和dC4T4C4）探討了銀納米簇的激發波長對堿基序列的選擇性。光譜分析表明以聚T堿基的DNA為模板合成的銀納米簇發出藍色或綠色熒光，而以聚C堿基的DNA為模板的銀納米簇除了可以發出藍、綠熒光，還可以發出紅色熒光。對dC4T4C4進行了研究表明簇的形成取決于寡核苷酸的濃度，較高的濃度有利于紅色熒光的產生，在較低濃度的dC4T4C4中，一種藍色/綠色的熒光納米簇占主導地位。

2011年，Yeh團隊［22］表明當DNA / Ag NCs與富含鳥嘌呤的DNA鏈靠近時，可以使Ag NCs的熒光從無到有，發出強的紅色熒光，或使紅色熒光增強，這依賴于Forster能量轉移作為熒光開/關（on /off）切換機制，且鳥嘌呤N7位點在觀察到的紅色熒光增強中起關鍵作用。當Ag NCs與富含胸腺嘧啶的DNA鏈鄰近時，產生綠色熒光增強，而富含腺嘌呤的DNA鏈鄰近時沒有產生任何可測量的熒光增強。

Li等［23］的研究表明，在充滿高密度葡聚糖的擁擠環境中制備的銀納米團簇與水溶液相比，具有更小的粒徑和更高的熒光量子產率。Cerretani等［24］的研究表明，5'-TTCCCACCCACCCCGGCCCGT-3'能穩定紅色和綠色發射極，并可通過加入H2O2或NaBH4引發兩團簇之間的切換。此外，一些非熒光中間體物質的形成會限制兩個發射器之間的完全可逆性。

3 DNA/銀納米簇介導的功能核酸傳感器

3.1 DNA/銀納米簇介導的“turn-on”型功能核酸熒光生物傳感器

核酸探針是指帶有標記物的序列已知的核酸片段，它可以與其互補的核酸序列雜交形成雙鏈。以DNA為模板生成的Ag NCs是目前一種新興的熒光探針，它比半導體量子點具有更小的體積，并且能比常用的有機染料有更好的光穩定性和亮度［16］。當Ag NCs足夠小時，它們表現出很強的光吸收和發射能力，這使得它們幾乎成為單分子光譜中理想的熒光基團［22］。另外，Ag NCs由于其光譜特性高度依賴于DNA的序列和結構，已被研究者廣泛應用于構建功能核酸熒光生物傳感器來進行生物分析。

3.1.1 無信號放大策略 在2011年，Kun等［25］發現DNA雙鏈中的堿基缺失位點（AP位點）可以作為Ag NCs生成的支架，在含AP位點的DNA雙鏈中，熒光Ag NCs的形成對AP位點表面的胞嘧啶和位點側面的鳥嘌呤具有高度選擇性。基于Ag NCs形成對AP位點微環境的依賴性，作者構建了一個“signalon”熒光傳感平臺用于DNA單核苷酸多態性（Singlenucleotide polymorphism，SNP）的檢測。當存在靶標鏈時，靶標鏈與探針結合，在AP位點處可形成Ag NCs，在670 nm波長處發出強熒光；當靶標鏈發生單堿基突變時，在AP位點處無法生成Ag NCs，無熒光產生。熒光Ag NCs對AP位點周圍序列的強烈依賴性已成功地用于鑒定癌癥抑制基因p53的密碼子177中的突變。

Zhu等［26］開發了一種新型的DNA / Ag NCs探針，用于基于TdT介導的聚合和支架鏈置換反應的原位凋亡細胞檢測和成像。為了制備開啟熒光DNA/ AgNC探針，應用含有兩個結構域I和II的單鏈DNA S1。富含胞嘧啶的結構域I對Ag+表現出強親和力，可以容易地制備熒光核酸穩定的Ag NCs。由于結構域II與BHQ標記的DNA S2部分雜交，猝滅劑位于Ag NCs附近，通過熒光共振能量轉移（FRET）有效淬滅DNA / Ag NCs的熒光。在凋亡細胞的細胞核中，TdT分別使用DSB和dATP作為引物和底物，將poly-dA添加到DSB的3'-OH末端。然后，細長的poly-dA鏈與DNA / Ag NCs探針的3'ploy-T突出端雜交，并啟動前端鏈置換。由靶poly-dA DNA鏈引發的鏈置換從DNA / Ag NC探針釋放猝滅劑標記的DNA，導致DNA / Ag NCs的顯著熒光點亮，用于敏感檢測細胞凋亡。該方法可以在體外檢測至少20個凋亡細胞。

3.1.2 有信號放大策略

3.1.2.1 鳥嘌呤接近 根據鳥嘌呤靠近使得熒光增強呈現的是一種“turn-on”的模式，當不存在目標分析物時，熒光銀納米簇與富含鳥嘌呤的增強序列是呈現完全分離的狀態，所以背景熒光信號非常低。Yeh等［27］發現以CCCTTAATCCCC為模板合成的銀納米簇，當模版延長部分序列與一段包含有富G序列的DNA雜交后，能夠得到熒光強度增強了500倍的紅色熒光銀簇。在此基礎上，該團隊還設計一個變色的銀納米簇探針（cNCB），在銀納米簇、富G序列和待測序列同時存在時產生橘色的銀納米簇熒光，而當待測序列的其中一個堿基發生突變后會產生紅色的銀納米簇熒光，兩種不同情況下合成的銀納米簇熒光發射波長卻相差幾十納米，因而實現對單堿基突變的檢測［28］。

Li等［29］提出了一種結合誘導熒光激活法來檢測α-淀粉酶，使用兩種適體（Apt15和Apt29），并通過序列元件進行修飾。使用12個核苷酸序列將第一個適體與5'末端的納米簇成核序列連接起來。第二個適體通過互補序列與3'末端的富含G的突出端連接。兩個適體探針與靶蛋白的結合啟動與每個適體連接的互補接頭序列之間的雜交，從而使富含G的突出端與Ag NCs緊密接近，導致顯著的熒光增強。通過該方法，對于人α-凝血酶，實現了1 nmol/L的檢測限和5 nmol/L-2 μmol/L的線性動態范圍。

3.1.2.2 金屬離子 Zhang等［30］報道了基于DNA /Ag NCs的信號增強熒光適體傳感器，用于同時檢測赭曲霉毒素A（Ochratoxin a，OTA）和黃曲霉毒素B 1（AFB 1）。在添加Zn2+后，熒光強度明顯增加，從而使OTA的檢出限低至0.2 pg/mL，AFB1的檢出限低至0.3 pg/mL。Lee等［31］用Ag+來觸發DNA/ Ag NCs的熒光從弱紅色轉換為強綠色來檢測Ag+。Ag+通過在兩個Cyt12/ Ag NCs之間形成橋，誘導Cyt12/ Ag NCs二聚體結構的形成，這種二聚體的形成使Cyt12-Ag NCs的熒光從紅色變為綠色。使用這種Ag+觸發的熒光轉換可檢測到濃度低至10 nmol/L的Ag+。

3.1.2.3 與其他納米材料結合 Khan等［32］開發了一種基于適配體銀納米簇（DNA / Ag NCs）/二硫化鉬納米片（MoS2）的熒光檢測真菌毒素T-2的方法。使用的DNA鏈包含3段，包括穩定銀簇片段（C12）、連接片段和T-2毒素適配體片段。以此DNA合成發紅色熒光的銀納米簇會吸附到二硫化鉬納米片表面，通過熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET），造成熒光猝滅。而目標物存在時，由于適配體作用，會把銀簇從納米片表面拉開，FRET作用失效，熒光恢復。基于此原理，對T-2進行了靈敏性檢測。動態定量范圍為0.005 ng/mL-500 ng/mL，檢測線為0.93 pg/mL。

3.2 DNA/銀納米簇介導的“turn-off”型功能核酸生物傳感器

3.2.1 生物大分子 Yang等［33］利用DNA納米銀簇（DNA / Ag NCs）的熒光特性，開發了一種能夠高特異性檢測靶miRNA存在的DNA / Ag NCs探針。首先設計了一條DNA序列，它具有針對靶miRNA的特異性互補序列和用于產生紅色發射Ag NCs的12個核苷酸的支架。當存在靶miRNA時，DNA /Ag NCs探針的發射顯著低于不存在靶miRNA或其他miRNA的情況。

作為生物硫醇，Cys在其參與可逆氧化還原反應、解毒和代謝過程中起著至關重要的作用。Wang等［34］開發了一種簡單的Cys檢測方法，檢測系統由DNA / Ag NCs和Cys檢測靶組成。DNA鏈由成核序列和富含G的適體序列組成，富含G序列的存在可以顯著增強Ag NCs的熒光信號，利用此DNA鏈作為模板合成一種具有強熒光信號的銀簇納米材料。在Cys或其他生物硫醇的存在下，由于S-Ag鍵的產生，DNA / Ag NCs的熒光可以被強烈猝滅。該方法對Cys的線性檢測范圍為0.1 nmol/L-100 nmol/L，檢測限為0.05 nmol/L。

3.2.2 金屬離子 Peng等［35］設計了一種新的熒光寡核苷酸穩定的銀納米團簇（DNA / Ag NCs）探針，用于靈敏檢測汞和銅離子。該探針含有兩個定制的DNA序列。一種是信號探針，其含有富含胞嘧啶的序列模板，用于Ag NCs合成和兩端的連接序列。另一種是富含鳥嘌呤的序列，用于信號增強和與信號探針的連接序列互補的連接序列。雜交后，基于DNA / Ag NCs在富含鳥嘌呤的DNA序列附近的熒光增強效應，雜交的雙鏈DNA / Ag NCs的熒光增強了200倍并且比單鏈DNA / Ag NCs穩定。在Hg2+或Cu2+存在的情況下可以猝滅其熒光，因此可以用作檢測汞和銅離子的新型熒光探針，線性檢測6.0-160.0和6 nmol/L-240 nmol/L范圍內的汞和銅離子，檢測限分別為2.1 nmol/L和3.4 nmol/L。

3.2.3 小分子 Ding等［36］提出了DNA模板銅/銀納米簇（DNA-Cu / Ag NCs）熒光探針用于選擇性檢測 S2-。 用 DNA 模 板（5'-CCCTTAATCCCC-3'） 合成具有優異熒光特性的DNA-Cu / Ag NCs熒光探針。然而，一旦引入含有S2-的溶液，由于硫離子與銀和銅原子具有強親和力，熒光DNA-Cu / Ag NCs探針的結構變化誘導其熒光淬滅。通過DNA-Cu / Ag NCs檢測的熒光強度的變化定量檢測S2-的濃度。所提出的方法允許在10 pmol/L-1 mmol/L的S2-濃度范圍內使用，檢測線為3.75 pmol/L。

3.3 DNA/銀納米簇介導的“比率型”功能核酸熒光生物傳感器

大多數Ag NCs只具有單一的熒光信號，阻礙了Ag NCs探針的實際應用和發展。因此，具有多個發射峰的變色龍Ag NCs為敏感的比率目標檢測提供了一種新的可能性。Zhou等［15］設計了一種新型的變色龍DNA模板Ag NCs，其熒光顏色可以通過互補DNA、非熒光輔助Ag NCs和Mg2+的調控在黃色、橙色和紅色之間進行切換。以A20-C55為模板的Ag NCs（A20-C55-NC）在磷酸鹽緩沖溶液中具有強黃色熒光（Y信號）。當通過模板雜交靠近無熒光輔助Ag NCs時，Y信號減少而新的紅色發射（R信號）上升，導致Ag NCs溶液從黃色到紅色的顯著顏色變化；另一方面，A20-C55-NC與互補DNA（T20）的雜交大大增強了Y信號；而A20-C55-NC在Mg2+存在下同時顯示出具有相同強度的R和Y信號；因此，變色龍Ag NCs實現了可控的多色熒光變化，無論是在雙鏈還是發夾形結構，比率探針都顯示出具有納摩爾敏感性的信號響應指數生長。

Wang等［37］構建了一種為單一熒光團的新型比率熒光納米傳感器已成功構建，用于超靈敏和特異性檢測Pb2+。G-DNA的G1區段與R-DNA的R1區段雜交，形成含有Pb2+依賴的DNAzyme的雙鏈體。G-DNA的G2區段模板化Ag NCs（G-DNA / Ag NCs）發射綠色熒光。同時，G2-1的片段與R2-1片段的雜交，不僅有助于穩定Pb2+依賴的DNAzyme的構型而且還使R2富G序列接近形成的G-DNA / Ag NCs，將綠色發射G-DNA / Ag NCs轉化為紅色。dsDNA/ Ag NCs含有Pb2+依賴的DNAzyme的rA切割位點，在Pb2+存在下，特異性DNA片段將從dsDNA/ Ag NCs釋放，導致DNA / Ag NCs從紅色變為綠色，由于Pb2+可以連續切割rA位點，因此從紅色到綠色發射的信號變化被放大。該傳感器從0.001 nmol/L-10 nmol/L表現出良好的線性關系，Pb2+測定的檢出限為1.0 pmol/L，低于大多數檢測Pb2+生物傳感器。

3.4 DNA/銀納米簇介導的功能核酸電化學生物傳感器

電化學生物傳感器因具有操作簡單、穩定性好、靈敏度高、可實時監測等優點，在食品安全、環境檢測、轉基因測定、醫藥工業等領域日益得到了科研工作者的重視。而金屬納米粒子一般具有較好的導電性能，催化性能及吸附能力，可以大大提高傳感器的靈敏度。Jie等［38］利用雙功能Ag NCs和多重擴增策略，合成了新型Ag NCs并將其用作多功能電化學發光和電化學信號探針。在長dsDNA模板修飾的電極上原位合成了大量Ag NCs，放大了電化學發光信號，用于靈敏檢測凝血酶。DPV峰電流顯示出與1.0 fmol/L-10.0 nmol/L的目標濃度的對數線性依賴性，測限在3σ時為0.1 fmol/L。

Quan等［39］開發了一種基于銀納米團簇（Ag NCs）/辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）納米復合物（Ag NCs-HRP）的納米探針，用于癌胚抗原（Carcino-embryonic antigen，CEA）的電化學檢測。通過含有CEA適體和C12的DNA模板合成Ag NCs。隨著HRP吸附到Ag NCs上，形成了可以與CEA特異性結合的納米探針（Ag NCs-HRP）。將抗CEA抗體，CEA和納米探針依次裝配到電極表面后，電極表面的HRP可催化3，3'-二甲氧基聯苯胺（DB）聚合形成PDB絕緣聚合物薄膜。因此，Fe（CN）63-/4-溶液中電極的氧化還原電流減小，并且降低的氧化還原電流與檢測到的CEA濃度成比例，實現了對CEA檢測的高靈敏度。降低的電流與CEA在1 pg-10 ng/mL范圍內的濃度呈對數關系，檢測限為0.5 pg/mL。

3.5 DNA/銀納米簇介導的其他類型功能核酸生物傳感器

3.5.1 溫度傳感器 大多數的溫敏材料只有單一的信號響應，沒有更好的熒光穩定性和對比度。Oemrawsingh和 Zhao等［40-41］的研究為 Ag NCs的熒光受溫度變化的調控提供了明確的證據，但熒光Ag NCs對溫度并沒有明顯的線性響應。Zhou等［42］首次報道了一種新型的雙熒光溫度敏感型DNA模板化Ag NCs對，成功地指示了活細胞的溫度，并且證明了溫度誘導的熒光響應是由于DNA模板的雜交和去雜交引起的Ag NCs對的整合和分離。用兩個富含C的DNA支架合成銀納米簇（A1-NC，A2-NC），由于A1和A2具有互補序列，使A1-NC，A2-NC彼此靠近，從而獲得了對溫度敏感的銀納米簇對（A-NCP）。A-NCP在 640 nm（A-FL640） 和 570 nm（A-FL570）處呈現兩個明亮的發射帶，而B-NCP在685 nm（B-FL685）和620 nm（B-FL620）處實現熒光峰值。隨著溫度的升高，A-NCP（A-FL570）的熒光發射增加，A-FL640減少；B-NCP（B-FL685和B-FL620）的熒光發射同時降低。因此，A-NCP熒光顏色顯示出從橙色到黃色的變化，而B-NCP的熒光顏色從橙色變為無色，實現了對應于15-45℃溫度的敏感變化。此外，發夾型（AH和BH）模板合成的銀納米簇的熒光對溫度也有類似的響應效果。

3.5.2 石英晶體微量天平生物傳感器 Zhou等［43］開發了一種新型石英晶體微量天平（QCM）生物傳感器，以DNA / Ag NCs作為高效信號放大器，實現了對核酸進行高靈敏度和無標記的檢測。用探針DNA對QCM進行修飾，使其特異性地捕獲目標DNA。然后，將DNA模板化的Ag NCs組裝起來，通過與DNA骨架相連的Ag+增強QCM傳感器的靈敏度，然后氫醌誘導Ag NCs的還原形成。用TEM和AFM進一步證實了DNA模板化Ag NCs的形成。結果表明，在這種放大模式下，QCM傳感器的頻率響應高達87倍。頻率響應與DNA濃度在0.6 nmol/L-30 nmol/L范圍內呈線性關系，檢出限為0.1 nmol/L。

3.5.3 智能邏輯生物傳感器 作為信號轉導器，DNA / Ag NCs優于有機染料和量子點，因為DNA /Ag NCs的使用不僅避免了DNA與信號指示劑的共價標記，而且更容易被引入DNA邏輯系統［44］。這些內在特性賦予DNA / Ag NCs在并行/級聯邏輯門和計算電路的開發中具有前景的應用。

Zhang等［45］構造了基于銀納米團簇（Ag NCs）/氧化石墨烯（GO）的一系列邏輯電路以執行非算術功能，包括3位、4位和5位奇數/偶數檢查，由此產生的設備可以區分0-31范圍內的偶數和奇數十進制數。另外，這些裝置可以在生物基質中穩定地執行它們的邏輯操作，表明基于Ag NCs / GO的系統可以在復雜的生物環境中操作。Fan等［44］結合GO對DNA模板化Ag NCs的猝滅能力和G-四鏈體增強的卟啉染料熒光強度，首次構建了無標簽、無酶的2-to-1、4-to-2編碼器和1-to-2解碼器。此外，Lin等［46］首次將DNA / Ag NCs的多路復用器用作智能生物傳感器，以高靈敏度識別大腸桿菌和金黃色葡萄球菌致病基因，在通用平臺上集成多個DNA邏輯門，實現了先進的邏輯功能。該研究簡單易用，為多分子器件的集成和智能診斷提供了一種有指導意義的方法。

4 DNA/銀納米簇介導的功能核酸生物傳感器的應用

4.1 DNA/銀納米簇用于胞內成像

在過去的20年中，具有分子樣能級的少數原子貴金屬納米團簇已經成為具有顯著光電性質的新型熒光團［47］。由于DNA / Ag NCs易于合成的途徑，良好的光穩定性和生物相容性以及高量子產率的優良特性，使其成為許多應用的有力候選者，特別是在生物成像方面［48］。

4.1.1 細胞成像 靈敏、特異的腫瘤細胞檢測不僅對腫瘤的早期診斷，而且對腫瘤轉移的研究具有重要意義。Ai等［49］利用AS1411為模板來合成銀納米團簇以發掘其潛在應用。在形成銀納米團簇后，AS1411仍然保持其結構并且能夠與癌細胞中的核仁蛋白結合。同時，這種結合可以極大地增強銀納米團簇的熒光強度。該性質可直接用于HeLa細胞的生物成像。

Li等［50］受到真核細胞核中普遍存在的端粒含有重復DNA序列TTAGGG的啟發，基于DNA /Ag NCs在細胞核內的原位熒光激活作用，開發了一種新穎、簡便、無標記、特異性和通用的細胞核成像方法。NC-a模板化的Ag NCs和富含G的b序列將通過與DNA探針C-ab互補而聚集在一起。從而使Ag NCs的熒光激活。此外，研究者還根據端粒的重復序列TTAGGG設計了具有不同富含G序列的5個探針。結果表明，在C-ab存在下，所有五種探針均可作為Ag NCs的有效熒光增強劑，從而進一步驗證了無熒光的Ag NCs可以通過端粒序列激活。然后用CEM細胞作為模型，流式細胞術測定顯示無熒光的Ag NCs可以快速進入細胞并且在沒有洗滌的簡單孵育后，熒光被強烈激活，實現了原位細胞成像。

Yin等［51］提出了一種基于識別誘導的適配體構象改變從而使富含鳥嘌呤的DNA序列靠近DNA /Ag NCs，利用熒光增強效應來檢測癌細胞的策略。DNA探針是發夾結構，由3'端的目標特異性適配體序列、富含鳥嘌呤的DNA序列和5'端的臂段（表示為識別探針）組成。另一個作為信號探針，包含一個用于Ag NCs模板合成的序列和一個與識別探針的ARM段互補的鏈接序列。適體與癌細胞的識別和結合迫使識別探針進行構象改變，進而啟動識別探針的臂段與信號探針的連接序列之間的雜交。然后Ag NCs靠近富含G的DNA，從而增強熒光。實驗結果表明，該策略采用特異性適配體sgc8c能對CCRF-CEM細胞進行特異性成像，在200 μL結合緩沖液中檢測到低至150個CCRF-CEM細胞。

4.1.2 酶活檢測 Huang等［52］構建了一種新型熒光報告基因，可以實現端粒酶活性的檢測。此外，探針成功用于區分正常細胞和癌細胞，并監測用抑制模型藥物治療后的實時端粒酶活性反應。低熒光的H-Ag NCs探針設計含有3個功能性DNA支架（H序列）：Ag NCs的模板序列polyC、T5環、9個堿基的互補序列。探針中的端粒DNA可以在端粒酶存在的情況下延伸，得到幾個重復的TTAGGG序列，然后重復序列與探針中的互補序列雜交形成自發夾結構，由于富含G序列接近而導致 Ag NCs顯著的熒光增強。基于熒光增強，可以檢測和成像細胞內端粒酶活性。相反，如果細胞中端粒酶活性不足，底物不能延長，則無法觀察到H-Ag NCs探針的熒光。

4.2 DNA/銀納米簇的抑菌作用

一定的時間內，銀納米抗菌劑可以使某些細菌、真菌或病毒等微生物的生長繁殖保持在必要水平以下。納米銀可通過3種機制破壞細菌膜：首先，從納米銀中釋放出的Ag+可以在細菌膜中遷移，從而導致細胞死亡；其次，細胞質中的巰基或細胞質中的磷基團與Ag+之間的相互作用會導致活性氧（ROS）的產生，從而抑制DNA的復制能力。最后，細胞膜和銀納米之間的靜電相互作用形成了可作為運輸屏障的壁坑［53-54］，從而使細胞出現功能障礙而死亡。

Yang等［55］首次使用支鏈DNA作為支架來調節銀納米團簇（super-Ag NCs）的形成，其空間結構被精確設計和構建。ssDNA的互補黏端的雜交合成分支的DNA / Ag NCs，實現了具有可調形狀和臂長的超級Ag NCs，包括Y、X和（Y-X）形超級Ag NCs。超級Ag NCs表現出優異的抗菌性能，濃度為20 μmol/L的（Y-X）-super-NC可使細菌生長延遲至8 h。超級Ag NCs增強抑菌效果的原因可能是超級NCs提供更高濃度的Ag+并且其分支結構增加了Ag+與細菌接觸以及與細菌表面黏附的機會。

Javani等［56］探討了 DNA / Ag NCs在革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌中的抗菌特性。在測試了9種具有不同序列和長度的寡核苷酸后發現，抗菌活性取決于所用寡核苷酸的序列。將Ag NCs按熒光顏色分組為藍色、黃色和紅色發射體，結果表明，藍色發射體產生的抗菌活性較差，而黃色和紅色發射體則具有與硝酸銀相似的活性。并基于以上發現制備了三聚體結構，其中含有提供最佳抗菌活性的序列，其可以抑制亞微摩爾范圍內革蘭氏陽性和陰性細菌的生長。

5 總結與展望

本文介紹了基于DNA / Ag NCs開發的一系列生物傳感器，總結了其在分析檢測、體內成像及抑菌方面的應用。總的來說，DNA / Ag NCs介導的生物傳感器可以檢測生物體內特定酶的活性、某一段基因序列、重金屬，真菌毒素等多種靶標分子，還可以基于細胞成像進行癌細胞以及酶活的檢測。此外，DNA / Ag NCs的形狀以及DNA模板序列對其抑菌作用都有影響。

目前對于DNA / Ag NCs生物傳感器的研究仍處于探索階段，如何有效的控制DNA / Ag NCs核的生長速率，提高材料的性能還需要繼續研究。現有的研究在DNA / Ag NCs熒光的轉變以及增強的機制還不夠清晰，對DNA / Ag NCs的形貌調控和納米尺寸上的排布還不夠精準。另外，盡管銀納米簇具有許多優良的物理化學性質，如尺寸小，水溶性好，耐漂白性能強和生物毒性小等，但穩定性仍是限制其應用的主要因素之一，因此，合成穩定的銀納米簇也是未來研究工作中的重要課題之一。

雖然DNA / Ag NCs生物傳感器已經拓展出成百上千種應用，但衍生出的檢測方法主要基于對DNA模板的精巧設計，未來可在其他方面進一步探究。如與新型納米材料、復合納米材料等結合，賦予DNA / Ag NCs更多優良的性質并研究其雜化規律，建立新的傳感方法。

DNA / Ag NCs在生物成像方面的應用仍處于起步階段，在未來的研究中可以用其來感測細胞內活性物質如三磷酸腺苷（ATP）等。此外，還可以進一步利用其成像特性來進行藥物篩選以及藥物的定向投遞，拓展其在醫學領域的應用。

為了提高Ag NCs的抗菌效率，可以通過將Ag NCs與商品化抗生素結合來開發有效的抗菌材料。另外，Ag NCs的一個獨特特性是它們顯示出強發光性。這可以促進可追溯抗菌劑的開發，除了監視它們與細菌細胞壁的相互作用外，發光信號還可以用于檢測其細胞內的積累。最后，還可以借助Ag NCs的發光來研究抗菌機理。銀屬于重金屬，對細胞有與一定的毒害作用。在臨床實驗中，準確了解Ag+的釋放量，可以最大程度地減少基于Ag的抗菌劑可能引起的細胞毒性，還需要對DNA / Ag NCs進行更加深入的研究，解決這些細節問題。