沉積物中菲高效降解菌群的篩選鑒定及降解特性

張永敏 王天慧 王萍

（安徽工業大學能源與環境學院，馬鞍山 243002）

沉積物作為底棲生物的棲息場所和水生生態系統的重要組成部分，是地球化學循環和生態系統耦合的重要發生區域，是地球上各種人為源及自然源污染物的重要儲存庫。排入水體的持久性有機污染物大量富集在沉積物中，造成沉積物中持久性有機污染物濃度一般比上部水體高出1-2個以上的數量級［1］，并且可能會造成水體長期的二次污染，這不僅給水生生態系統帶來危害，而且可通過食物鏈的傳遞對人類健康構成威脅。

多環芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一種典型的疏水性有機污染物［2］，由兩個或兩個以上苯環組成的，廣泛存在于沉積物、水體、土壤和大氣中，可通過森林火災、火山爆發、石油泄漏、工業排放等［3］自然和人為過程釋放到周圍環境中。其中，菲（Phenanthrene，PHE）是一種三環PAHs，因其具有潛在致癌性、致畸性、致突變性及遺傳毒性，受到人類廣泛關注。

PAHs的微生物修復因其經濟、高效且無二次污染等特點，已成為去除環境中PAHs的理想方法和重要手段［4］。目前，研究人員已從環境中分離出多種 PAHs降解菌［5］。Kamyabi等［6］篩選出一株以芘（Pyrene，PYR）作為唯一碳源和能源的細菌菌株Basidioascus persicusEBL-C16可在21 d降解300 mg/L的PYR，降解率為89.3%。Li等［7］獲得一株白腐真菌Pycnoporus sanguineus14在14 d降解20 mg/L的PHE，降解率為45.6%。相較于單一菌株，含有不同微生物種類的復合菌群修復效果更好，如Bacosa等［8］和 Bharatkumar等［9］富集得到的菌群對PAHs均有較高的降解率，分別是10 d 降解95%的PHE和5 d降解70.21%的PHE。這主要是由于在自然環境中，微生物修復依賴于混合菌群的協同代謝作用，一些微生物代謝降解過程中產生的中間產物可作為其他微生物的生長底物［10］，繼而更為完全的降解修復。除此之外，復合菌群適應性更強、抗沖擊能力更高。

就目前而言，在微生物降解持久性有機污染物工作中，重心多放在土壤中PAHs降解菌群的富集篩選，而對河流沉積物中PAHs高效降解菌群的篩選及降解特性研究較少?；诖?，本研究從受長期鋼鐵企業污染的內河河流采集表層沉積物，經富集篩選后得到一組菲高效降解菌群，作為進一步的生物修復資源研究菌群生物群落結構特征，并測試在不同環境條件下降解菲的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌群來源與試劑 菌群來源：從馬鞍山市內河流六汾河（31°42'N，118°27'E）采集表層沉積物樣品，以菲作為唯一碳源進行長期馴化，后經富集分離得到菌群。沉積物樣品經檢測，其16種PAHs濃度在695.70 ng/g-33 830.20 ng/g之間，平均濃度為6 894.36 ng/g，組分以4環、5環為主［11］。

試劑：菲（純度＞99%）；甲醇、正己烷和丙酮均為HPLC色譜純；其他藥品均為分析純。

1.1.2 培養基 無機鹽液體培養基（g/L）［12-13］：K2HPO4·3H2O 4.25，NaH2PO4·H2O 1，NH4Cl 2，MgSO4·7H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.012，MnSO4·H2O 0.003，ZnSO4·7H2O 0.003，CoSO4·7H2O 0.001。蒸餾水1 000 mL，調pH為7。

PAHs無機鹽培養基：將菲溶于丙酮中制成一定濃度，過0.22 μm濾膜除菌后加入到無機鹽液體培養基中，待丙酮揮發完后制成PAHs培養基。

上述培養基均在121℃高溫滅菌20 min備用。

1.2 方法

1.2.1 高效降解菌群的富集分離 取表層沉積物樣品10 g加入到90 mL無菌水中，加入一定量玻璃珠在150 r/min、35℃條件下震蕩3 h。靜置2 h后取5 mL上清液加入45 mL PAHs無機鹽培養基中，使得菲濃度為100 mg/L，于150 r/min、35℃條件進行避光培養7 d。一周后取5 mL上清液加入到45 mL PAHs無機鹽培養基中，使得菲濃度為150 mg/L。富集7次后，每次富集菲濃度增加50 mg/L，直到菲濃度到達400 mg/L。由此得到的菌液作為儲備菌液。

1.2.2 16S rRNA基因高通量測序高效降解菌群 16S rRNA基因高通量測序具體步驟為：儲備菌液經預處理后收集菌體；按照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit的使用說明書提取儲備菌液DNA，檢測DNA完整性；利用Miseq測序平臺的V3-V4通用引物，構建PCR反應體系，進行PCR擴增。

341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG

805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAG AATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC

PCR結束后，PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測；對PCR擴增片段進行DNA純化回收，定量混合后上機檢測測序。16S rRNA基因高通量測序工作委托上海生工生物股份有限公司完成。

16S rRNA基因高通量測序數據分析：在Miseq測序過程中含有barcode序列以及測序時加入的引物和接頭序列，對于得到的原始序列（reads）數據，首先需要去除引物接頭序列，再根據雙端測序reads之間的重疊關系，將成對的reads拼接成一條序列，然后按照barcode標簽序列識別并區分樣品得到各樣本數據，最后對各樣本數據的質量進行質控過濾，得到各樣本有效數據。將有效序列按照序列間的距離進行聚類，按照97%相似水平分成不同的操作單元分類（Operational taxonomic unit，OTU），按照RDP（Ribosomal Database Project）classifier方 法 對OTU進行物種分類，并繪制菌群群落結構分布圖。

1.2.3 高效降解菌群降解率 取儲備菌液5 mL加入到pH為7的45 mL PAHs無機鹽培養基中，使得菲濃度為100 mg/L，以50 mL不加菌PAHs無機鹽培養基為空白對照組，于150 r/min、35℃條件下進行避光培養，每隔12 h進行取樣，利用高效液相色譜測定剩余菲濃度、計算降解率，考察菌群降解能力。1.2.4 pH對高效降解菌群降解特性的影響 將PAHs無機鹽培養基的pH分別調整為2、3、4、5、6、7、8、9、10和11。取儲備菌液5 mL分別加入到不同pH的45 mL PAHs無機鹽培養基中，使得菲濃度為100 mg/L，以50 mL不加菌pH為7的PAHs無機鹽培養基為對照組，于150 r/min、35℃條件下進行避光培養，考察pH對高效降解菌群降解影響，3 d后取樣測定剩余菲濃度、計算降解率。

1.2.5 溫度對高效降解菌群降解特性的影響 取儲備菌液5 mL加入到pH為7的45 mL PAHs無機鹽培養基中，使得菲濃度為100 mg/L，以50 mL不加菌PAHs無機鹽培養基為對照組，分別于20、25、30、35和40℃溫度條件下以150 r/min進行避光培養，考察溫度對高效降解菌群降解影響，3 d后取樣測定剩余菲濃度、計算降解率。

1.2.6 不同鹽度對高效降解菌群降解特性的影響 改變無機鹽培養基鹽度、調節pH為7，取儲備菌液5 mL加入到45 mL鹽度分別為0%、1%、2%、3%和4%的PAHs無機鹽培養基中，使得菲的初始濃度為100 mg/L，于150 r/min、35℃條件下進行避光培養，以50 mL不加菌PAHs無機鹽培養基為對照組，3 d后取樣測定剩余菲濃度、計算降解率。

1.2.7 初始濃度對高效降解菌群降解特性的影響 改變菲初始濃度，將初始濃度分別設置為200、300和400 mg/L，取儲備菌液5 mL加入到45 mL pH為7的上述不同濃度PAHs無機鹽培養基，以50 mL不加菌PAHs無機鹽培養基為對照組，于150 r/min、35℃條件下進行避光培養，考察初始濃度對高效降解菌群的降解影響，于1、2、3、5和7 d取樣測定剩余菲濃度、計算降解率。

以上實驗均設置3個平行，取值為平均值。

1.2.8 檢測方法 液體中菲的檢測：因菲難溶于水，為保證實驗準確性，需進行整瓶取樣。

樣品處理：取樣后用等體積的正己烷進行液液萃取，將上清液收集，下層液重復萃取。萃取3次后合并萃取液，在40℃旋轉蒸發濃縮，過無水硫酸鈉柱子，后氮吹至干加入10 mL甲醇進行溶劑替換。稀釋一定倍數后4℃冰箱保存待用高效液相色譜進行檢測。

HPLC檢測條件：色譜柱為C18反相色譜柱，柱溫為30℃，流動相為甲醇∶水=90∶10，進樣體積為20 μL，停留時間9 min，紫外檢測波長為254 nm。

生物量的測定：取培養樣品5 mL，采用可見分光光度計在600 nm波長下檢測菌群的光密度（OD600），以OD600表示生物量。

2 結果

2.1 高效降解菌群的群落結構

經多次富集分離，從表層沉積物中富集得到一組新型菲高效降解菌群，命名為LYH-1。對菌群進行16S rRNA基因高通量測序，得到LYH-1菌群58 783個堿基對，平均長度為424.11 bp。LFH-1菌群具體群落組成及結構分布如表1和圖1所示。

在目層面上，LFH-1菌群主要含有Burkholderiales（87.9%）、Pseudomonadales（8.86%）、Rhizobiales（1.86%）、Xanthomonadales（0.79%）等菌株種類。此外，亦含有一些所占比例較少的菌株種類 如 Clostridiales、Candidatus Brocadiales、Flavobacteriale等。

在屬水平上，LFH-1菌群主要包括硝基黃桿菌（Diaphorobacter）83.35%、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）7.46%、反硝化卡斯特蘭尼氏菌（Castellaniella）1.67%、水微菌屬（Aquamicrobium）1.65%、無色桿菌（Achromobacter）0.68%，嗜麥芽窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）0.39%、熱單胞菌屬（Thermomonas）0.34%、不動桿菌屬（Acinetobacter）0.16%和嗜氮根瘤菌屬（Azorhizophilus）0.13%。

表1 order水平LFH-1菌群所含堿基對及所占比例

圖1 genus水平LFH-1菌群群落結構分布圖

2.2 高效降解菌群降解率

LFH-1菌群降解率如圖2所示。從圖2可得知LFH-1菌群對菲有高效降解效果，于60 h降解率可達到95.78%。菌群接種后幾乎沒有滯后期，肉眼可見菲含量降低、培養基顏色由透明色轉變為土黃色澄清狀且伴有絮狀生物膜產生（圖3）。在48 h時，LFH-1菌群生物量達到頂峰，此時菲降解率可達到84.86%。在48 h過后，菌群生物量有稍許下降，但降解率未受生物量降低影響，依舊緩慢升高。于84h可將菲降解至不可檢測水平。

圖2 LFH-1菌群降解率

圖3 菌群初接種（左）及培養3 d后（右）無機鹽培養基表觀變化

2.3 高效降解菌群降解特性

2.3.1 pH對降解菌群降解效率影響 pH對降解菌群降解效率影響如圖4所示。

圖4 pH對菌群降解效率影響

結果表明，LFH-1菌群能在pH4-11之間生長，體現出LFH-1菌群廣泛的pH適應范圍，同時，LFH-1菌群在pH5-11之間降解率均能達到98%以上，且更適合弱堿環境。當pH為2-3時，LFH-1菌群降解率在30%以下，菌群生長量不足0.05，近乎未生長。當pH為4時，LFH-1菌群降解率可達到55%左右，菌群開始緩慢生長。對培養3 d的培養基重新測定pH，發現培養基pH保持在6.44-7.33之間，培養基pH發生較大改變。

2.3.2 溫度對降解菌群降解效率影響 溫度對降解菌群降解效率影響如圖5所示。

圖5 溫度對LFH-1菌群降解效率影響

從圖5可以看出，LFH-1菌群在20-40℃均能生長，且在35℃降解效果最好。就降解率而言，菌群在20-35℃降解率逐步增大，在35℃降解率達到98.61%，近乎完全降解菲，而在40℃時，降解率急劇式下降僅有20.94%，

2.3.3 不同鹽度對高效降解菌群降解特性的影響 鹽度對菌群降解效果影響如圖6所示。由圖6可以看出，在鹽度為0-4%的范圍內，LFH-1菌群降解率與菌群生長量均隨著鹽度的增加而下降。當鹽度為0%時，LFH-1菌群降解效率最高，可近乎完全降解菲；當鹽度為1%時，LFH-1菌群降解效率影響不大，降解率可達到97.26%；當鹽度為2%時，LFH-1菌群降解急劇式下降，降解率僅為51.75%，菌群生長量也僅為0.127；當鹽度為3%和4%時，菌群降解率降至較低水平。

2.3.4 菲初始濃度對降解效率影響 改變菲初始濃度，探究菲初始濃度對LFH-1菌群降解效率影響，結果如圖7所示。從圖7可知，LFH-1菌群整體降解趨勢為平緩至增大后穩定狀態。在接種初期，LFH-1菌群均存在一個緩沖期，隨著濃度的增大，緩沖期適當延長。LFH-1菌群可降解濃度為400 mg/L的菲，在第7天，剩余菲濃度為14.55 mg/L，降解率達96.36%。圖7表明，LFH-1菌群不僅高效降解菲，且能在較高菲濃度范圍內正常生長，表明LFH-1菌群有較廣的濃度適應范圍。

圖6 鹽度對LFH-1菌群降解效果的影響

圖7 初始濃度對LFH-1菌群降解效果的影響

3 討論

本研究通過多次富集分離從長期受鋼鐵企業污染的河流沉積物中得到一組新型好氧微生物菌群，經16S rRNA基因高通量測序發現LFH-1菌群群落結構組成新穎，其中優勢菌種Diaphorobactersp.在多環芳烴降解方面鮮有報道。Klankeo等［14］發現Diaphorobactersp.對多環芳烴有降解能力，能在16 d內降解99%的100 mg/L的PYR，且能在8 d內完全降解100 mg/L的PHE，表現出Diaphorobactersp.對多環芳烴的降解性。多數研究認為Diaphorobactersp.對苯酚類有一定的降解能力，段佩玲等［15］篩選出一株以苯酚為唯一碳源的Diaphorobactersp.，能在苯酚濃度為4 g/L環境中生長，通過鄰苯二酚-2，3-加氧酶基因進行代謝。Yang等［16］富集篩選出一株Diaphorobactersp.，命名為TPD-1，該菌株可將50 mg/L三唑磷和PHT完全降解至不可檢測水平。

除Diaphorobactersp.外，LFH-1菌群也含有Pseudomonassp.。較Diaphorobactersp.而言，已有大量的研究表明Pseudomonassp.對多環芳烴具有降解能力。Kuppusamy等［17］篩選出一株Pseudomonassp.，能夠降解3環至5環多環芳烴。Ma［18］及Chebbi等［19］也篩選出Pseudomonassp.可降解菲、芘等多環芳烴。對于Castellaniellasp.與Aquamicrobiumsp.報道較少：Castellaniellasp.多數是從水及海水中篩選，常用于海洋中石油烴的降解；Aquamicrobiumsp.多數從水、土壤中篩選，常用于硝基苯降解。結合菌群群落結構組成及各個菌株主要用途，發現占據成分較多的菌株多是對菲有直接降解能力的，而含量較少的菌株多是對環數較少的苯系物或烴系物的降解，即以菲的中間產物作為主要降解目標物，體現出混合菌群的協同代謝作用。

LFH-1菌群降解實驗表明其對菲有著高效降解能力，對比其他研究（表2），LFH-1菌群所表現的降解能力可為后續菲污染水體或土壤提供微生物修復新的種質選擇。

表2 不同菌群對多環芳烴降解效果對比

LFH-1菌群生長和降解特性實驗表明該菌群具有廣泛的pH適應范圍，此研究結果與 Patel等［25］研究結果相似，除此之外菌群更適應堿性脅迫可能是因為沉積物中pH值和氧化還原電位是控制多環芳烴降解的兩個重要參數，在好氧的情況下，弱堿環境更適合多環芳烴礦化［26］。對培養3 d培養基測定pH，發現pH值維持在中性附近，是因為微生物本身具有一定的調節pH值的能力，使得pH值處于比較適宜的狀態?；诖?，推測LFH-1菌群有廣泛的pH生長范圍是由于菌群內部各微生物互相調節，使得環境更適應生長，繼而達到高效降解效果。對于溫度影響，菌群在高溫情況下生長及降解能力欠佳，引起這一現象的原因可能是因為溫度過高，引起酶活性降低，導致降解下降。研究表明［27-28］，細菌降解菲主要是在雙加氧酶、脫氫酶及其他各種酶的作用下進行開環、脫氫。經過復雜的開環過程，最終被降解為CO2和H2O。鹽度是影響降解菌群降解效果的關鍵因素之一，鹽度過高細菌可能會脫水進入休眠期［29］。LFH-1菌群可耐受0-2%的鹽度，在實際應用中可耐受較高的鹽含量，抗沖擊負荷能力強。

針對不同初始濃度影響，建立Monod模型［30-31］，對菌群進行降解反應一級動力學模擬。動力學方程式經推導為：

式中：c為污染物濃度，mg/L；為反應時間，d；K為降解速率常數。

當污染物濃度降解到一半時，所需要的時間稱之為半衰期。對于一級反應而言：

式中，K為降解速率常數。

利用公式1和公式2 對一組菌群進行動力學模擬，模擬結果見表3。

表3 LFH-1菌群對菲的降解動力學方程及參數

結果表明，當濃度范圍為200 mg/L-400 mg/L時，LFH-1菌群半衰期在1-44 h之間，并隨著初始濃度的增加，降解速率逐漸下降。當降解濃度為200 mg/L時，半衰期僅為13.01 h，降解速率最快，半衰期最短。基于目前所做的工作，對后期研究進行展望：探究菌群如何協同作用，降解途徑的判斷；篩選高效單一菌株并結合固定化技術進行多環芳烴生物修復。

4 結論

從長期受鋼鐵企業污染河流中沉積物富集出一組新型菲高效降解菌群，命名為LFH-1。利用16S rRNA基因高通量測序對LFH-1菌群進行微生物種類分析，結果表明LFH-1菌群主要包括硝基黃桿菌（Diaphorobacter）83.35%，假單胞桿菌屬（Pseudomonas）7.46%，反硝化卡斯特蘭尼氏菌（Castellaniella）1.67%，水微菌屬（Aquamicrobium）1.65%，無色桿菌（Achromobacter）0.68%，嗜麥芽窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）0.39%，熱單胞菌屬（Thermomonas）0.34%，不動桿菌屬（Acinetobacter）0.16%，嗜氮根瘤菌屬（Azorhizophilus）0.13%。

富集分離出的LFH-1降解菌群在接種量為10%、pH7、溫度為35℃、150 r/min、初始菲濃度為100 mg/L的條件下48 h內菌群生長量達到頂峰，此時菲降解率為84.86%；在60 h，菲降解率達到95.78%；在84 h，近乎完全降解菲，降解達到平衡。

LFH-1菌群生長和降解特性實驗表明：菌群可在pH為5-11范圍內生長且保持較高的降解率；菌群最適溫度為35℃，當溫度為40℃時，降解率降至較低水平；鹽度為1%時對菌群影響較小，降解率依舊保持在97.26%；菌群可耐受初始濃度為400mg/L的菲，對不同初始濃度降解曲線進行分析，LFH-1菌群降解規律基本符合一級動力學方程，當濃度范圍為200 mg/L-400 mg/L時，LFH-1菌群降解半衰期在13-44 h之間。