產L-谷氨酸工程菌株的誘變選育及其發酵效率

梁玲 黃欽耿 翁雪清 吳松剛 黃建忠

（福建師范大學生命科學學院 工業微生物教育部工程研究中心，福州 350117）

L-谷氨酸（L-glutamate，L-Glu）是生物體內的重要營養物質，參與動物、植物、微生物細胞內的蛋白質代謝過程［1］。L-谷氨酸在食品行業中廣泛用作增鮮劑，另外在醫藥、人造制革、化妝品工業及農業生產上也具有廣泛的用途，是目前世界上產量最大的氨基酸［2-5］。L-谷氨酸最早是在1866年由德國化學家以小麥面筋水解而得［6］，近一個世紀之后，隨著谷氨酸生產菌的分離得到與研究改造，逐步過渡到采用發酵法進行生產。隨著谷氨酸棒桿菌基因組信息注解及微生物育種技術的進步，谷氨酸的發酵水平得到極大的提升。然而，從產酸水平和糖酸轉化率來看，我國谷氨酸發酵生產還落后于國際水平［7-9］。因此，選育L-谷氨酸高產菌株，進一步提高產酸水平及轉化率，對谷氨酸清潔生產具有重要的意義。

常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變系統能夠在常壓下產生25-40℃的具有高活性粒子濃度的等離子體射流，通過作用于微生物細胞造成有效的DNA多樣性損傷［10-11］，具有操作簡便、設備簡單、條件溫和、安全性高、誘變快速、產生突變的多樣性大等特點［12-13］，是新近發展起來的非常安全高效的誘變系統。在氨基酸菌株選育方面，都比較多的集中在ARTP的直接誘變，如楊立鵬等［14］采用ARTP方法選育到一株高產L-色氨酸的突變株TRP-YP-3-2，其L-色氨酸產量達到61.4 g/L，糖酸轉化率達到19.25%，分別較出發菌提高了15.41%和22.77%，而且遺傳穩定，生長速率高。蔡友華等［15］利用ARTP誘變集合48孔板篩選，獲得突變株1905#，其能夠耐受更低的pH，搖瓶產酸較出發菌株提高99.6%，遺傳穩定。另外，將細胞制備成原生質體，去除了細胞壁的保護，使得細胞對誘變因素更為敏感，對原生質體進行ARTP誘變處理，操作簡便易行，可大大提高誘變的效果。如蔣順進［16］以綠色產色鏈霉菌AVL4為研究對象，通過原生質體ARTP誘變，篩選獲得變株S251，其50 L罐發酵阿維拉霉素水平最高達到4 500 μg/mL，較對照菌株AVL4提高27.4%。公維亮等［17］采用原生質體ARTP誘變，結合雙親酶活的原生質體融合方案，獲得GSM-4、GSM-5兩株那西肽效價提高15%以上的突變菌株，體現了非常好的選育效果。在谷氨酸高產菌株的選育方面，鮮有原生質體ARTP誘變選育的報道。

本研究以經過多次誘變及代謝改造的高產L-谷氨酸的谷氨酸棒桿菌工程菌（Corynebacterium glutamicum）GY1為研究對象，對該菌株的原生質體形成和再生的條件進行探索，并對原生質體進行ARTP誘變，全局誘變L-谷氨酸工程菌，獲取更多樣的細胞膜及基因損傷，最大限度的獲得突變菌株庫，以期獲得產酸及糖酸轉化率提高的突變株。誘變的主要的流程如圖1所示。

圖1 L-谷氨酸高產菌株原生質體ARTP誘變選育流程

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發菌種 谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicumGY1（FluAr/ProAr/Glnr/odhA-/pckA-/dtsR1-/ltsA-/alaT-），由工業微生物教育部工程研究中心保存。

1.1.2 培養基 斜面培養基及固體平板培養基（g/L）：葡萄糖5.0，豆粕提取物18.0，酵母粉10.0，磷酸二氫鉀1.0，尿素3.0，丁二酸0.5，瓊脂粉20.0，生物素 10.0 μg/L，pH7.0，121℃滅菌 20 min。

種子培養基（g/L）：葡萄糖22.0，酵母粉 10.0，豆粕提取物20.0，硫酸鎂 0.4，尿素10.0，丁二酸 1.0，硫酸亞鐵 0.01，硫酸錳 0.01，甲硫氨酸0.5，生物素0.4 mg/L，維生素B10.2 mg/L，pH7.0，121℃滅菌20 min。

發酵培養基（g/L）：葡萄糖80，豆濃 30，玉米漿干粉35，豆粕提取物10，糖蜜10，毛發水解物2.3，甜菜堿1.2，丁二酸3.75，尿素6.0，硫酸鎂1.6，磷酸二氫鉀12.5，蘇氨酸0.015，賴氨酸0.015，甲硫氨酸 0.05，天冬氨酸 0.12，FeSO4·7H2O 0.8 mg/L，MnSO4·3H2O 0.8 mg/L，抗壞血酸 0.08 mg/L，對氨基苯甲酸 0.08 mg/L，生物素0.08 mg/L，維生素B10.03 mg/L，維生素 B122.5 μg/L，pH7.0，121℃滅菌20 min。

再生培養基：在固體平板培養基的基礎上添加0.5 mol/L的蔗糖即為再生培養基。

1.1.3 主要藥品和試劑 SMM緩沖液：0.5 mol/L 蔗糖，0.02 mol/L MgC12·6H2O，0.02 mol/L 順丁烯二酸，pH7.0，121℃滅菌 20 min。

甘氨酸溶液：稱取1 g甘氨酸溶于10 mL水中，用0.22 μm的針頭式過濾器過濾除菌，-4℃保藏。

溶菌酶液：稱取0.2 g溶菌酶，溶于10 mL SMM緩沖液，即溶菌酶濃度為20 g/L，用0.22 μm的針頭式過濾器過濾除菌，-20℃保藏。

1.1.4 主要儀器設備 SBA-40D 型生物傳感分析儀由山東省科學院生物研究所制造；UV-2100型紫外可見分光光度計由尤尼柯（上海）儀器有限公司制造；梅特勒 pH計由瑞士梅特勒-托利多集團制造；ARTP-IIS 型ARTP誘變儀由無錫源清天木生物科技有限公司制造。

1.2 方法

1.2.1 原生質體的制備與再生 原生質體制備：取一環保藏于-80℃冰箱的谷氨酸棒桿菌GY1，接種于3 mL的種子培養基中，30℃，220 r/min振蕩培養12 h，吸取1mL菌液至裝有30 mL種子培養基的250 mL三角瓶，添加1 mL 10%的甘氨酸，30℃，220 r/min振蕩培養12 h，培養結束后，將菌液6 000 r/min離心10 min，SMM高滲緩沖液洗滌離心兩次，棄去上清，得到制備原生質體的出發菌。取一部分用高滲液適當稀釋，吸取100 μL涂布于固體培養基上，30℃培養至長出菌落，計算菌落數A。

以SMM溶液作為高滲液，在出發菌中加入溶菌酶液，使終濃度分別為2.5、5.0、7.5、10.0和12.5mg/mL，轉入直徑為6 cm的平皿，放置于恒溫振蕩器，30℃，60 r/min條件下分別酶解30、60、90、120和150 min，隨后2 500 r/min離心10 min，棄上清，用SMM溶液洗滌離心兩次，最后加入3 mL SMM溶液重懸細胞，得到原生質體懸液。

原生質體再生：原生質體懸液用SMM溶液梯度稀釋后取100 μL涂布于再生培養基平板上，30℃培養2 d長出菌落，計算菌落數B。另外，將原生質體用無菌水梯度稀釋后涂布于再生培養基平板，30℃培養2 d，計算長出的菌落數C。根據實驗結果結合后續實驗需求選擇合適的原生質體制備與再生條件。原生質體再生率=（B-C）/（A-C）×100%。

1.2.2 ARTP誘變 參照ARTP 誘變育種儀操作流程，將原生質體懸液加入終濃度為5%的甘油作為保護劑，吸取10 μL原生質體懸液均勻涂于載片，將載片轉入操作倉，以氦氣作為工作載氣，功率為110 W，通氣量為10 L/min，距離為2 mm，進行誘變處理。處理時間設置為10、20、30、40、50、60、70和80 s，誘變結束后將載片轉入SMM高滲液中，30℃，60 r/min振蕩15 min，確保將原生質體全部洗脫下來，然后稀釋涂布至再生培養基平板，30℃培養2 d至長出單菌落，進行平板菌落計數，以處理0s的樣品為對照，計算致死率并繪制致死率曲線，選擇致死率約為85%-90% 的處理時間對原生質體進行誘變。

1.2.3 突變株的篩選 再生培養基平板培養2 d后長出單個菌落，挑選外觀形態與對照菌株（如菌落大小、形狀、色澤等）存在差異的的單菌落轉接至谷氨酸固體平板，30℃培養24 h，然后用96微孔板發酵進行初篩，采用生物傳感分析儀測定谷氨酸含量，選擇產酸提高幅度較大的突變株進行搖瓶復篩。從固體平板菌落接種至斜面，以原始出發菌株GY1為對照，30℃培養24 h后，按2%的接種量接種至種子培養基中，30℃，220 r/min培養24 h，再以10%的接種量轉至發酵搖瓶，30℃，220 r/min，振蕩培養24 h后溫度調至37℃，繼續發酵24 h后結束培養。分析發酵液中 L-谷氨酸含量、菌體生物量。L-谷氨酸含量采用生物傳感器分析儀測定。

1.2.4 50 L發酵罐補料分批發酵驗證 采用三級發酵工藝，以搖瓶種作為一級種子接入二級種子罐，接種量為2%，再以20%的移種量從種子罐移種至發酵罐，發酵周期為36 h，控制發酵罐參數：罐壓0.05MPa，初始通氣量1∶1.5 vvm，培養24 h后提高至1∶1 vvm，發酵前期溫度為30℃，培養至OD562達到80后升溫至37℃誘導表達谷氨酸；初始攪拌300 r/min，初始葡萄糖濃度為100 g/L，初始PH7.0，發酵期間每隔 2 h 取樣檢測菌體生物量（OD562）、L-Glu含量及殘糖，根據耗糖速率確定補料量，流加質量分數為20% 的氨水控制pH在6.9-7.1，通過控制攪拌和補料維持發酵過程溶氧（DO）在15%-35%，流加700 g /L葡萄糖溶液控制發酵過程中葡萄糖濃度在4.0-7.0 g/L，發酵結束前 2-4 h停止補料，當殘糖基本耗盡時，發酵結束。

2 結果

2.1 最佳原生質體制備與再生條件的選擇

2.1.1 不同溶菌酶濃度對原生質體制備的影響 由圖2可知，在一定時間內（本實驗時間為90 min），隨著溶菌酶濃度的增加，谷氨酸棒桿菌GY1原生質體生成率逐步提高，在酶濃度為12.5 mg/mL時達到最高，繼續提高溶菌酶的濃度，原生質體數量略有下降。當酶濃度比較低的時候，再生率隨著酶濃度增加而提高，當溶菌酶濃度為10.0 mg/mL時，再生率達到峰值21.3%，繼續提高酶濃度，再生率急劇下降。可能是由于過高的酶濃度使細胞壁酶解過度，將細胞壁徹底降解，進而對細胞膜造成損傷，不利于原生質體再生。結合原生質體制備量和再生率的綜合考慮，選取最佳的溶菌酶濃度為10.0 mg/mL。

2.1.2 溶菌酶作用不同時間對原生質體制備的影響 在制備原生質體的過程中，原生質體的數量隨著酶解時間的延長逐步增加，在顯微鏡下觀察可見越來越多的棒狀細胞轉變為球狀的原生質體，最終幾乎全部酶解成為球形原生質體。由圖3可見，原生質體的制備量隨著時間的延長而增加，但是當酶解時間過長時，再生率顯著下跌。可能原因是酶解太長時間導致細胞壁全部去除，進而損傷質膜系統，使原生質體質量下降難以再生。綜合考慮原生質體的制備率再生率，使用10 mg/mL的溶菌酶處理90min為最佳酶解時間。

圖2 酶濃度對原生質體制備的影響

圖3 酶解時間對原生質體制備的影響

2.2 ARTP處理時間的選擇

根據ARTP誘變不同的時長，再生后平板長出的菌落數，以未經誘變的平板菌落數為對照，計算致死率，繪制致死率曲線（圖4）。由圖4可知，ARTP處理60 s時，GY1原生質體已達到100%的致死率，處理20 s，致死率達到55.7%。鑒于出發菌株GY1本身經歷了多次物理化學誘變，而且谷氨酸棒桿菌具備的限制修飾系統，在ARTP處理時間的選擇方面，一方面想通過ARTP處理強化菌株原生質體損傷的 “程度”，獲得較多的DNA損傷，另一方面也盡可能保證有一定數量的再生菌落進行篩選，增加獲取優良變株的機率，選擇致死率為90%左右的處理時長，即處理40 s（致死率為89.6%）作為最佳的ARTP誘變時間。

2.3 突變株的篩選

原生質體進行ARTP誘變后，在長出單菌落的再生平板上，根據菌落的形態特征如菌落大小、光澤度或顏色，隨機挑取了760個單菌落進行96微孔板初步篩選，篩選結果表明，有 136個菌株比出發菌株產酸提高，正變率為17.9%，選取其中 60 株產酸較出發菌株提高12%以上的菌株進行搖瓶復篩，產酸結果見表1。由表1可見，有22株誘變菌株在搖瓶發酵中產酸比對照菌GY1高，最高的一株為YAG117，L-Glu含量達16.3 g/L，較GY1提高13.9%。

圖4 ARTP處理時間對GY1原生質體致死率的影響

表1 誘變菌株搖瓶復篩谷氨酸產量

2.4 遺傳穩定性分析

誘變株通常穩定性較差，為驗證該變株的穩定性，將變株連續傳代5次，每次傳代進行搖瓶發酵驗證L-Glu產量，均設置3個平行實驗，結果如表2。從菌株形態特征上看，變株YAG117在傳代過程中穩定性良好，菌落形態及顯微形態都沒有變化，而且L-谷氨酸產量變化幅度在3%以內，體現了較好的遺傳穩定性。

表2 斜面傳代對突變株YAG117谷氨酸含量的影響

2.5 50 L罐補料分批發酵

根據原有的發酵工藝，將變株YAG117與出發菌株GY1進行50 L罐發酵對比驗證，每隔2 h測定生物量，殘糖及L-Glu含量，繪制發酵曲線，結果如圖5。結果顯示，變株YAG117與出發菌株GY1有相似的生長曲線，葡萄糖消耗速度趨于一致，細胞生長性能優于對照菌株，菌體密度從發酵之初就比對照菌株生長迅猛并維持在較高水平，展現了很好的環境適應性和生長特性。從L-谷氨酸產量上看，L-谷氨酸積累在發酵初期就高于對照菌株，并且產酸勢頭強勁，隨著菌體密度對數生長迅速積累，在菌體生長進入穩定期后，產酸保持增速。發酵30 h以后，產酸增加速度下降，在發酵36 h時產酸達到216.6 g/L，較出發菌株GY1（發酵36 h產酸191.9g/L）提高了12.9%，糖酸轉化率比出發菌株提高了10.2%。整個發酵周期誘變菌株YAG117產酸均比對照菌株GY1高，發酵過程穩定，糖酸轉化率達到68.87%，展現了非常好的工業應用前景。

圖5 菌株YAG117/GY1分批補料發酵代謝曲線

3 討論

谷氨酸棒桿菌GY1是一株工業化發酵生產的L-谷氨酸的工業菌株，期間經歷多代的傳統誘變及代謝改造，在多次的誘變修飾過程中往往積累了較多的細胞結構及生理上的不利突變，致使細胞出現一定的“死胡同”效應，而且谷氨酸棒桿菌作為一類革蘭氏陽性菌株，其細胞壁較厚，細胞修復機制復雜，使得進一步通過普通誘變的方式對菌株改良變得非常困難。ARTP作為一種新近發展起來的全局誘變工具，其較普通的紫外及化學誘變方式來說具有更高的突變率、更多樣的DNA損傷和蛋白突變類型，而且沒有方向性和偏好性［11］。通過去除細胞壁，制備原生質體，結合ARTP這種不常見的誘變體系對于經歷多次誘變的工業菌株更加有利于形成L-谷氨酸生物合成相關代謝網絡的全局變化，最終形成遺傳穩定的突變株。

制備數量多，質量優的原生質體是進行原生質體ARTP誘變的前提，酶法破壁制備原生質體的過程中，酶濃度、酶解時間對原生質體的制備率及再生率影響顯著。酶濃度太低，細胞壁不能被有效去除，不能形成原生質體；酶濃度太高，則可能會損傷細胞膜，造成細胞存活率不高。酶解時間的影響與酶濃度相似，時間不足時細胞壁尚未去除，原生質體數量少，而時間太長，細胞膜可能會受到損傷，影響細胞再生［17］。另外，出發菌的活力也對原生質體的形成與再生影響顯著，對數生長期的細胞代謝活躍、一致性好，收集此時期菌體制備原生質體可得到較好的制備效果，不僅如此，在培養細胞的過程中添加適量的甘氨酸或氨芐青霉素能使細胞壁的合成受阻，造成細胞壁的結構疏松，有利于酶解破壁［18］。本研究通過優化原生質體制備條件、選取最佳的ARTP處理時間，既保證一定數量的細胞個體，又能夠兼容足夠的誘變豐富性。從760個突變株中獲得136株正突變株，正變率達到17.9%，相對較低的正變率也再次體現了工業菌株對誘變體系的“疲勞”作用，最終通過96孔板的初篩和搖瓶復篩獲得L-谷氨酸發酵水平顯著提高的變株YAG117，L-Glu含量達16.3 g/L，較GY1提高13.9%，50 L罐分批發酵36 h，L-谷氨酸產量達到216.6 g/L，比出發菌株提高了12.9%，較戶紅通等［19］通過優化清潔發酵工藝的谷氨酸產量提高了12.5%，也是目前文獻報道最高水平，這充分體現了原生質體ARTP誘變在工程菌株改良中的良好效果。值得注意的是，優良變株從傳代菌株整體的產酸水平來看，連續傳代3次L-谷氨酸的產量基本不變，但到第4代時（F4），L-谷氨酸產量下降幅度加大，所以，在進行生產實踐或是發酵中試時，為取得較好的產酸水平，建議一次菌株的斜面傳代次數不超過3代，以F2代斜面菌株進行進一步的發酵最佳。

原生質體的ARTP誘變作為傳統誘變育種的補充，能夠有效的進行包括細胞膜在內的細胞全方位損傷，有利于獲取全局擾動的突變株，從而實現選育目標，但其還是無法在機制及機理上解釋突變株的代謝變化，接下來，可以借助組學的分析方法，全面比較出發菌株及突變株的組學數據，增進對突變株L-谷氨酸全局代謝的認知，有利于尋找新的L-谷氨酸生物合成擾動點，為L-谷氨酸工程菌的構建提供新的理論支持。

4 結論

以高產L-谷氨酸的谷氨酸棒桿菌GY1為出發菌株，采用10.0 mg/mL的溶菌酶酶解90 min制備原生質體，隨后在綜合考慮致死率及菌落數的條件下，利用ARTP處理40 s。突變株經96微孔板初篩及搖瓶復篩，最終獲得L-谷氨酸產量明顯提高的的優良突變株YAG117，搖瓶產酸為16.3 g/L，較出發菌株GY1提高13.9%，同時，進行50 L罐的補料分批發酵驗證，其L-谷氨酸產量達到216.6 g/L，糖酸轉化率達到68.87%，較出發菌株GY1分別提高12.9%和10.2%。