轉錄水平分析轉速對克拉維酸發酵產量的影響機制

宋道平 康妮 張佩佩 宗工理 王世立 張堃鈺 曹廣祥 付加芳

（1. 濟南大學 山東省醫學科學院 醫學與生命科學學院，濟南 250022；2. 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）山東省醫藥生物技術研究中心，濟南 250062）

克拉維酸（Clavulanic acid，CA）是一種氧青霉烷類廣譜β-內酰胺酶抑制劑，為治療β-內酰胺類抗生素耐藥菌感染的臨床藥物。CA由棒狀鏈霉菌（Streptomyces clavuligerus）發酵產生，發酵條件優化是提高CA產量的有效手段之一［1-3］。

克拉維酸的生物合成途徑已經基本闡明。同位素喂養實驗證實3-磷酸甘油醛（G3P）和精氨酸是克拉維酸生物合成的前體物質［3-4］，然后經過六步催化反應合成關鍵中間產物-克拉維胺酸［5］，克拉維胺酸是CA和5S克拉維烷合成代謝的分支點，在此后的反應中部分克拉維胺酸在克拉維酸合成晚期基因如cad、cyp450和oppA1等作用下合成克拉維酸［6-7］，另一部分則通過5S分支途徑形成克拉維烷-2-羧酸、丙氨酰克拉維烷和2-羥甲基克拉維烷等多種5S克拉維烷產物［8-10］。多株S. clavuligerus的基因組已經完成測序［11-14］，研究發現3個基因簇與克拉維酸生物合成有關，分別為克拉維酸基因簇、克拉維烷基因簇和旁系同源基因簇。克拉維酸基因簇包含克拉維酸生物合成途徑多數合成酶的基因，比如ceaS2、bls2、pah2、cas2、oat2、gcas、car、cyp和fd等，位于頭霉素C合成基因簇的下游；克拉維烷基因簇包含克拉維酸合成酶基因cas1和5S分支途徑的合成基因；旁系同源基因簇位于內生質粒pSCL4，包含多個同源基因比如ceas1、bls1、pah1和oat1［14］。此外，CA合成受到復雜的調控作用，ClaR和CcaR是CA合成的途徑特異性調控因子［15-16］，而雙組份信號轉導系統CagRS可以同時調控CA和CA前體物質的合成基因［17］，此外，研究還顯示γ-丁內酯信號系統［18］、上游調控因子 BldG［19］、δ-因子Orf21［20］、氨基酸匱乏［21］都影響 CA 的合成。

S. clavuligerusF613-1是CA的工業生產菌株，來源于標準菌株ATCC27064的長期育種篩選。工業生產經驗表明發酵過程中提高攪拌轉速能夠提高F613-1菌株的克拉維酸產量和縮短發酵周期，推測可能與高轉速能提高發酵液溶氧水平和傳質效果有關，但并不清楚其具體的分子機制。因此，本研究擬通過轉錄組測序比較分析在高轉速發酵和低轉速發酵條件下F613-1菌株轉錄組差異，分析CA合成相關基因簇、前體物質G3P和精氨酸代謝相關基因的變化情況，以期從轉錄水平闡明高轉速發酵條件影響CA合成的分子機制，為進一步通過基因工程方法提高CA產量提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 棒狀鏈霉菌S. clavuligerusF613-1。

1.1.2 培養條件 F613-1孢子的收集采用BSCA固體培養基（麥芽提取物1.5%，胰蛋白胨0.3%，葡萄糖0.4%，瓊脂粉2%，pH7.5），25oC培養10 d 收集孢子。CA液體發酵培養：按106個/mL的接種量將孢子接種于SCZ培養基（大豆超細粉2%，玉米淀粉1.2%，酵母自溶物0.5%，磷酸氫二鉀0.08%，甘油酸三油酯 1.1%（V/V），pH 7.1）中，25℃、250 r/min培養48 h得到種子液，然后按5%接種量轉接至SCF發酵培養基（大豆超細粉2.7%，大豆蛋白提取物2.2%，麥芽糊精3.0%，氯化鉀0.15%，六水氯化鎂0.1%，磷酸氫二鉀0.2%，二水氯化鈣0.04%，六水三氯化鐵0.008%，氯化鋅0.001%，氯化鈉0.018%，MOPS 4.2%，甘油酸三油酯1.6%（V/V），pH 7.1），25℃培養，轉速分別設為200 r/min和300 r/min。

1.2 方法

1.2.1 發酵液總糖含量和還原糖含量的測定 液體發酵過程中分別在發酵0、24、48、72、96、120和144 h取1 mL發酵液測定發酵液中總糖和還原糖濃度，檢測方法參照前期研究進行［22］。

1.2.2 胞內精氨酸含量的測定 分別在發酵24、48、72、96、120和144 h取1 mL發酵液，離心收集菌體，測量菌體濕重，然后按照精氨酸（Arg）檢測試劑盒（上海紀寧，96T）測定胞內游離精氨酸的含量。

1.2.3 發酵液CA含量的HPLC檢測 取1.2.1中發酵液，離心取上清液后用0.22 μm 濾膜過濾，參照前期研究采用HPLC測定CA含量［22］。

1.2.4 轉錄組測序與分析 收集1.2.1中發酵72 h的發酵液，采用TRIzol（Ambion）抽提法提取鏈霉菌F613-1總RNA，質檢合格后去除核糖體RNA 并進行片段化處理，逆轉錄合成單鏈cDNA，再合成雙鏈cDNA并純化，接著末端修復并加接頭引物后進行PCR擴增并純化，采用illuminaHiseq2500 測序平臺和PE150測序方式進行轉錄組測序（銳博生物）。原始測序數據首先進行數據質量分析，然后用參考基 因S. clavuligerusATCC27064（NZ_CM001015.1-NZ_CM001019.1）進行比對。轉錄組數據采用tbtools軟件進行火山圖制作，采用Prism8進行數量差異分析。通過差異倍數（|log2FoldChange|>1）和顯著水平（q-value<0.001）兩個水平判斷樣本間差異表達的基因。

2 結果

2.1 不同轉速條件下CA產量的比較

每隔24 h收集不同轉速條件下的發酵液，分別進行CA含量、總糖含量和還原糖含量的測定。結果顯示在高轉速（300 r/min）條件下CA產量顯著高于低轉速（200 r/min）條件，其中在48、72和96 h時CA產量的提高趨勢最顯著，分別達到0.67、2.15和3.08 g/L，比低轉速條件提高了約2.23倍、2.44倍和1.32倍，而在發酵后期（120 h和144 h）CA產量的提高幅度降低，分別約為1.19倍和1.16倍（圖1-A）。高轉速條件下F613-1對總糖的消耗速度也顯著高于低轉速條件（圖1-B），說明高轉速條件下F613-1對糖的消耗更大，代謝水平更加旺盛。發酵過程中還原糖總體趨勢為先升高后降低，而高轉速發酵液在48 h和72 h時還原糖含量的升高幅度顯著高于低轉速發酵液，隨后還原糖含量快速下降（圖1-B），與高轉速發酵液中CA合成速度的趨勢一致，表明高轉速條件下高水平還原糖可能與CA合成速度增加有關，而且高轉速條件能夠縮短發酵周期。研究顯示糖代謝中間產物3-磷酸甘油醛是克拉維酸合成的前體物質［1，3，23］，因此，高轉速條件下旺盛的糖代謝水平可能是其高產CA的原因之一。

2.2 高轉速發酵和低轉速發酵的整體轉錄水平比較

本研究收集了高轉速和低轉速發酵條件下第72小時（CA合成高峰期）的菌絲體進行轉錄組測序。轉錄組測序數據經過質量篩選，高轉速樣品平均獲得16 721 348 個有效mRNA 信息，基因覆蓋率為97.04%，低轉速樣品平均獲得16 154 651個有效mRNA 信息，基因覆蓋率為96.84%。通過tbtools軟件進行基因轉錄水平差異分析并繪制樣本間基因差異火山圖（圖2），結果顯示高轉速樣品和低轉速樣品的轉錄水平之間存在統計意義上的顯著差異。與低轉速樣品相比較，高轉速樣品共有789個基因的轉錄水平發現顯著變化，其中419個基因轉錄水平顯著下降，370個基因轉錄水平顯著升高，說明發酵轉速在整體上顯著影響F613-1菌株的基因轉錄水平。

圖1 不同轉速條件下克拉維酸產量比較分析

2.3 CA生物合成基因簇的轉錄水平變化

S. clavuligerusF613-1中與克拉維酸合成相關的基因簇共有3個：克拉維酸基因簇、克拉維烷基因簇和旁系同源基因簇。對轉錄組數據進行差異分析，結果顯示與低轉速發酵條件下的轉錄組數據相比較，在高轉速條件下F613-1中CA合成相關3個基因簇中的大部分基因表達量無明顯變化（表1）。調控CA合成的調節基因claR，cagR和brp的表達量增加了1-1.5倍，而CA的途徑特異性正調控基因ccaR的表達量增加了2.19倍。

圖2 不同樣本間基因差異分析火山圖

表1 不同發酵轉速下CA合成途徑相關基因的表達差異比較

2.4 CA合成前體精氨酸和G3P代謝途徑基因的表達變化

精氨酸和3-磷酸甘油醛（G3P）是CA生物合成途徑的2個起始物質。差異分析顯示，與低轉速發酵條件下的轉錄組數據相比較，在高轉速條件下F613-1中精氨酸生物合成基因簇中所有基因（argH，argG，argR，argD，argB，argJ，argC）表達量整體上調大約1-2倍（表2）。本研究進一步分析了F613-1菌株在發酵不同時間段胞內精氨酸的含量，數據顯示在高轉速條件下F613-1胞內的精氨酸含量明顯增加（圖3），與轉錄組數據一致，說明F613-1在高轉速條件下可以積累更多的精氨酸，進而促進CA的合成。

表2 不同發酵轉速下精氨酸合成基因的表達差異比較

圖3 不同轉速條件下F613-1菌株胞內精氨酸含量比較分析

G3P 既是CA生物合成途徑的直接前體物質，同時也是糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑的重要中間產物。差異分析顯示，與低轉速發酵條件下的轉錄組數據相比較，在高轉速條件下F613-1中甘油轉化途徑中3-磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因（SCN_RS26820）表達量上調3.55倍（圖4），加速了甘油代謝，有利于G3P的合成。糖酵解（Glycolysis）途徑中多個酶的編碼基因表達量下調（圖4-A），從轉錄水平看，盡管通過糖酵解途徑產生的G3P和乙酰輔酶A（Acetyl-CoA）下降，但通過甘油酸三油酯（Glycerol trioleate）代謝途徑產生的G3P和Acetyl-CoA卻增加。另外，三羧酸循環（TCA）途徑中多個基因的表達量也不同程度的增加（圖4-C），有利于增強TCA過程。精氨酸是CA生物合成途徑的另一個前體物質，從轉錄水平看，在高轉速條件下F613-1中精氨酸生物合成基因簇中所有基因（argB，argC，argD，argJ，argG，argH）表達量整體上調大約1-2倍（圖4-B），有利于增強精氨酸的合成。根據轉錄組數據和總糖含量測定的實驗結果，本研究繪制了低轉速和高轉速兩種發酵條件下F613-1菌株的代謝通路變化（圖4）。結果顯示CA的合成能力與能量代謝正相關，與低轉速發酵條件相比，F613-1菌株在高轉速發酵條件下甘油轉化產生G3P過程、TCA過程和精氨酸合成途徑都有所提高，因此初級代謝途徑的改變可能是CA合成能力增強的原因之一。

圖4 F613-1菌株在不同轉速條件下代謝途徑變化情況

3 討論

S. clavuligerusF613-1是發酵生產克拉維酸的高產菌株，由長期的誘變育種和篩選獲得。與標準菌株ATCC27064的全基因組比較分析顯示：相比 ATCC27064菌株含有 pSCL1、pSCL2、pSCL3和pSCL4等4個質粒，F613-1只有一個0.7 Mb的質粒，進化分析其可能來源于ATCC27064菌株中pSCL2和pSCL4質粒的部分序列，因此F613-1菌株相比ATCC27064菌株具有較小的基因組；比較基因組分析發現F613-1和ATCC27064基因組具有較高的一致性，但F613-1基因組存在一個 RGP（Region of genomic plasticity）區域；此外，CA基因簇、克拉維烷基因簇和旁系同源基因簇的序列比對分析顯示兩個菌株之間僅在基因間隔區存在7個SNP位點。F613-1和ATCC27064的轉錄組比較分析顯示［22］：F613-1中CA基因簇和合成基因的轉錄水平整體顯著高于ATCC27064菌株，全霉素（另一個次級代謝產物）合成基因的轉錄水平則大幅下調，與此同時，精氨酸（CA合成的前體物質）的合成基因顯著上調，提示F613-1菌株高產CA的原因可能與CA基因簇的轉錄水平上調有關，同時菌株代謝流向的變化也可能促進了CA合成。

發酵條件優化是提高CA產量的有效手段之一［1-3］。本研究進一步分析了CA液體發酵過程中攪拌轉速對S. clavuligerus合成CA能力的影響。F613-1菌株在高轉速發酵條件下克拉維酸產量顯著提高，可能與高轉速能提高發酵液溶氧水平和傳質效果有關；轉錄組測序比較分析發現，在高轉速發酵條件下，CA合成基因簇中基因表達量變化雖不顯著，但CA合成途徑的調控基因ccaR表達量顯著增加，CcaR可能通過間接調控初級代謝進而影響了CA的合成；此外，轉錄組分析顯示F613-1菌株在高轉速發酵條件下，整個精氨酸合成基因簇中基因上調表達，因此本研究中F613-1精氨酸合成基因的上調可能會促進CA的合成。G3P是CA合成的另一個直接前體物質，總糖含量測定和轉錄組數據顯示，F613-1菌株在高轉速發酵條件下甘油代謝轉化為G3P過程、TCA過程明顯提高，這可能是F613-1在高轉速條件下CA產量提高的一個主要原因。

4 結論

發酵轉速顯著影響F613-1合成CA的速度，高轉速條件下CA合成速度加快并且CA產量提高。轉錄組測序顯示高轉速條件下基因轉錄水平發生顯著變化，涉及CA合成途徑相關基因及其途徑特異性正調控基因、精氨酸生物合成基因簇、G3P代謝途徑相關基因、TCA循環途徑相關基因。高轉速發酵條件促進精氨酸和G3P的合成可能對CA產量提高起到重要作用。