響應面法優化脯氨酸羥化酶轉化反應工藝條件

羅素亞 鄭豆豆 何廣正 張琳琳 徐書景 鞠建松

（河北師范大學生命科學學院，石家莊 050024）

反式-4-羥基-L-脯氨酸（L-羥脯氨酸，trans-4-hydroxy-L-proline）是膠原蛋白中特有的一種亞氨基酸，屬于非必需氨基酸，是羥化酶對L-脯氨酸羥基化修飾的產物，具有增強結締組織韌性和彈性的功效［1］。膠原蛋白含量最為豐富的材料是骨膠和明膠，骨膠、明膠中L-羥脯氨酸含量為10%-10.5%，脯氨酸含量為12%-13%［2］。人體中L-羥脯氨酸失衡會引發諸如老年癡呆、營養不良、組織纖維化、軟骨組織和韌帶組織韌性降低等癥狀［3］。目前，針對L-羥脯氨酸的研究和開發正受到食品、醫藥及美容等相關行業的廣泛關注［4-5］。此外，由于反式-4-羥基-L-脯氨酸具有兩個手性中心，易于衍生化，藥理活性多樣，因此，L-羥脯氨酸可作為醫藥原料藥的手性中間體，正被廣泛應用于合成抗高血壓、抗腫瘤、培南類新型抗生素等多種新型創制類藥物［6］。受這些因素的影響，反式-4-羥基-L-脯氨酸的需求量逐年上升，市場潛力巨大。

我國目前生產反式-4-羥基-L-脯氨酸主要采用化學水解提取工藝，該工藝以動物膠原蛋白為主要原料，通過強酸水解、亞硝酸氧化和離子交換等過程制備L-羥脯氨酸，其收率僅為4%-7%［4］，且存在著“三廢”排放量大、原料消耗量大、純度低及能耗高等不足；國外生產L-羥脯氨酸的主要方法為發酵法，即生物轉化法，該方法以L-脯氨酸和α-酮戊二酸為原料，輔以Fe2+、抗壞血酸鹽，通過脯氨酸羥化酶催化產生L-羥脯氨酸。目前用于生物法轉化的脯氨酸羥化酶（L-Proline 4-hydroxylase，P4hy，EC 1.14.11.57）主要來自指孢囊菌（Dactylosporangiumsp.）RH1，該基因（GenBank：D78338.1）的GC含量為73.63%，異源表達時主要以包涵體呈現，且催化活性低，影響了該酶的推廣和應用［5，7］。

本實驗室在不改變P4hy的氨基酸序列條件下，通過密碼子優化將其GC含量降低至61.45%，所構建表達載體pET-P4hy在分子伴侶質粒pG-KJE8的協同下，可溶性蛋白含量明顯提高，催化反應轉化率為72.8%［8］。本實驗以表達載體pET-P4hy為研究對象，優化蛋白表達條件和轉化反應條件，采用響應面法預測催化反應的最適條件，進一步提高其催化反應轉化率、降低生產成本，為生產反式-4-羥基-L-脯氨酸奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和試劑 大腸桿菌BL21（DE3）用于蛋白表達，分子伴侶質粒pG-KJE8購自TaKaRa公司，質粒pET-P4hy由本實驗室構建［8］，標準品L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸購自Sigma公司，2-（N-嗎啡啉）乙磺酸鈉（MES）、三羥甲基甲胺基乙磺酸（TES）、哌嗪-N，N-二（2-乙磺酸）（PIPES）和三（羥甲基）氨基甲烷（Tris-HCl）等化學試劑為分析純。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素和氯霉素均購于Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 重組菌誘導條件優化

1.2.1.1 誘導溫度優化 將表達載體pET-P4hy轉化至帶有分子伴侶質粒pG-KJE8的大腸桿菌BL21（DE3）中，37℃過夜培養后挑取單一菌落培養，隨后將種子液以10%的接種量轉接到含有卡那霉素（40 μg/mL）和氯霉素（25 μg/mL）的LB液體培養基中，37℃ 180 r/min振蕩培養至OD600為0.5-0.7時，加入誘導劑IPTG（0.1 mmol/L），分別在不同溫度下（16℃、20℃、24℃、28℃和32℃）誘導培養6 h，4℃1 000 r/min離心10 min收集菌體。

將1 g 菌體重懸浮于10 mL轉化反應液［200 mmol/L L-脯 氨 酸、200 mmol/L α-酮 戊 二 酸、6 mmol/L 硫酸亞鐵、2 mmol/L L-抗壞血酸、80 mmol/L MES緩沖液（pH 6.5）和1% Nonidet P-40］中，每組3個平行實驗，28℃，140 r/min振蕩培養，間隔一定時間取樣，離心去除菌體，通過HPLC（Wondasil C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）檢測反應液中L-羥脯氨酸的轉化率（以標準品的含量和所對應的峰面積作標準曲線，計算酶蛋白催化生成L-羥脯氨酸的轉化效率），確定其最適誘導溫度。

1.2.1.2 IPTG濃度優化 按1.2.1.1所述條件培養重組菌，改變誘導劑濃度（0、0.05、0.1、0.2和0.3 mmol/L），于28℃繼續培養6 h，離心收集菌體。以全細胞為催化劑，參照1.2.1.1所述方法檢測反應液中L-羥脯氨酸的轉化率，確定最佳誘導劑濃度。

1.2.2 轉化反應條件優化

1.2.2.1 轉化反應溫度優化 在28℃，0.2 mmol/L IPTG下誘導培養重組菌6 h，離心收集菌體。稱取1 g菌體，懸浮在10 mL轉化反應液中，置于不同反應溫度（20℃、24℃、28℃、32℃和37℃）下恒溫孵育，按照1.2.1所述方法檢測L-羥脯氨酸的轉化率，確定最適轉化溫度。

1.2.2.2 反應緩沖液及其pH值優化 取1.2.1所培養的菌體1 g，分別重懸于80 mmol/L的MES、TES、PIPES和Tris-HCl緩沖劑中，緩沖液pH為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，轉化反應液中其他成分與1.2.1一致，于28℃ 140 r/min振蕩反應60 h，通過HPLC檢測上清中L-羥脯氨酸的轉化率，確定轉化反應的最適緩沖液及pH值。

1.2.2.3 緩沖液濃度的篩選 稱取1.2.1所培養的菌體1 g，重新懸浮于10 mL轉化反應液中，改變MES和TES緩沖液的濃度（0、20、40、80、120、160、200和240 mmol/L），轉化反應液的其余成分與1.2.1相一致，參照1.2.1所述方法檢測L-羥脯氨酸的轉化率，確定緩沖液的最佳濃度。

1.2.2.4 底物配比優化 α-酮戊二酸是脯氨酸羥化酶輔底物，其濃度高低可能對脯氨酸羥化酶的催化活性產生一定的影響［9］。稱取1.2.1所述菌體1 g，懸浮于10 mL轉化反應液中（緩沖液濃度參照1.2.2.3中的最佳濃度），其中 L-脯氨酸終濃度固定為200 mmol/L，倍比降低α-酮戊二酸的濃度，使之與L-脯氨酸的濃度之比分別為1/1、1/2、1/4、1/8、1/12和1/16，檢測反應液中L-羥脯氨酸的轉化率，篩選α-酮戊二酸的最佳濃度。

1.2.2.5 表面活性劑濃度篩選 表面活性劑具有增加細胞通透性的功能，有利于底物與酶蛋白接觸，從而提高酶的催化效率［10-11］。前期實驗檢測發現，分別向轉化反應液中添加表面活性劑CTAB、SDS、Tween 20、Trixton X-100和Nonidet P-40后，僅Nonidet P-40表現出對酶蛋白的催化活性有一定影響，而其他4種表面活性劑的影響較小。因此，參照1.2.2.4中的最佳底物配比，調整轉化反應液中表面活性劑Nonidet P-40的濃度，檢測產物L-羥脯氨酸的轉化率，確定Nonidet P-40的最佳濃度。

1.2.3 響應面法優化P4hy轉化反應條件 響應面分析法（Response Surface Methodology，RSM）是20世紀中后葉發展起來的優化試驗條件的統計學方法，現已經廣泛應用于微生物發酵條件的優化［12-13］。響應面法可同時對影響生物產量的各因子水平及其交互作用進行優化與評價［14-15］，因此可快速有效地確定多因子系統的最佳條件。

根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，綜合單因素所得實驗結果，采用響應面分析法優化P4hy轉化反應條件（緩沖液pH值，轉化反應溫度和振蕩速度），分析各因素的主效應和交互效應，繪制響應面立體分析圖，尋求最佳水平，進而確定最佳工藝條件。

2 結果

2.1 重組菌誘導條件優化

2.1.1 誘導溫度的優化 通過HPLC檢測發現，20℃和28℃下誘導所得重組菌的轉化率隨轉化反應時間的延長呈現先快后緩的上升態勢（圖1-A），當反應達68 h時，20℃和28℃誘導所得重組菌的轉化率接近85%，其他3個溫度下誘導獲得的重組菌轉化率均低于50%；當反應達100 h，5個誘導溫度下重組菌的轉化率均可達100%。由此可見，20℃和28℃是較為理想的誘導溫度，但考慮到28℃接近于室溫，實驗可操作性較好，因此，確定誘導溫度為28℃。

2.1.2 IPTG濃度優化 在不同IPTG濃度下誘導所得重組菌的產物轉化率如圖1-B所示：產物轉化率均隨反應時間的延長而逐漸增加，其中未加誘導劑的重組菌轉化反應的轉化率增幅最小，72 h時其轉化率僅為20%；IPTG為0.2 mmol/L時產物轉化率增幅最快，反應進行至60 h時，產物轉化率接近100%；而在相同反應時間下，其它濃度下重組菌的轉化率均低于65%，說明重組菌誘導所需IPTG的最佳濃度為0.2 mmol/L。

2.2 優化轉化工藝條件

2.2.1 轉化反應溫度的優化 重組菌在不同轉化反應溫度下的產物轉化率隨時間變化而不斷增長（圖2-A）。在28℃下，產物轉化率的增長更為快速，當反應時間達60 h和80 h時，反應產物轉化率分別達97%和100%；而在24℃和32℃下，當反應進行至36 h后，產物轉化率也呈急劇上升態勢，但最終二者的產物轉化率仍然沒有達到100%。因此，最適反應溫度為28℃。

2.2.2 緩沖劑種類及pH值篩選 由圖2-B可見，當以Tris-HCl作為緩沖液時，產物轉化率一直徘徊于30%左右，而其他緩沖體系下產物轉化率則隨著pH值的增加（pH 6.0-6.5）而快速增長：當pH為6.5時，各緩沖溶液體系下的反應產物轉化率均達到最大值（MES，100.0%；TES，95.8%；PIPES，93.1%）；當pH值繼續上升（pH 6.5-8.0），產物轉化率呈現下降趨勢，其中，緩沖體系為MES時，重組菌的轉化率下降較為緩慢；由于MES緩沖體系在pH為6.5-7.0范圍內均具有較高的產物轉化率，因此，MES是較為理想的緩沖劑，其次是TES。

2.2.3 緩沖劑濃度的篩選 由圖2-C和圖2-D可見，當緩沖液MES和TES的濃度處于120-240 mmol/L之間時，產物轉化率隨反應時間的延長呈快速上升趨勢；當MES和TES濃度為120、240或200mmol/L時，反應60 h后產物轉化率可達100%；當緩沖液濃度介于0-80 mmol/L之間，產物轉化率的增長較為緩慢，當反應60 h時，其產物轉化率均低于90%。綜合考慮轉化反應成本，確定MES和TES緩沖液的最適濃度均為120 mmol/L。

2.2.4 優化底物配比 經HPLC檢測，在不同的底物配比下，重組菌的產物轉化率均隨反應時間的延長而增加（圖2-E）。當反應延長至60 h時，底物α-酮戊二酸與L-脯氨酸濃度之比分別為1/1、1/8和1/12時，產物轉化率均接近100%；不過，與其他底物配比相比較，底物之比為1/1時反應產物轉化率上升趨勢更加接近線性上升狀態，說明底物配比為1/1較為有利于生產L-羥脯氨酸。

2.2.5 Nonidet P-40濃度優化 通過檢測，在含有不同濃度的Nonidet P-40時，產物轉化率隨反應時間延長而呈不同程度的增長態勢（圖2-F）。當反應時間介于0-24 h，Nonidet P-40濃度為1.0%時，其產物轉化率增長速度較快；然而當反應時間介于24-48 h，與另外兩個濃度相比（1%和2%），Nonidet P-40濃度為1.5%時的反應產物轉化率增長最快；當反應時間為36 h，Nonidet P-40濃度為1.5%時，其產物轉化率率先達到最高值（100%），而其他濃度下則在反應進行至48 h才達到最高值。由此可見，Nonidet P-40的濃度采用1.5%為佳。

圖1 重組脯氨酸羥化酶誘導條件優化

2.3 Box-Benhnken試驗設計及響應面結果

綜合單因素實驗結果，采用三因素三水平法轉化反應溫度（A：24℃，28℃和32℃）、緩沖液pH值（B：6.0，6.5和7.0）和振蕩速度（C：100，140和180 r/min）等三因素進行研究，實驗設計及結果見表1、表2和圖3。表1為不同水平因素下產物轉化率的響應面值，根據表1實驗結果，通過design expert 7.1.6軟件處理確定回歸方程為：Y=73.49-11.72A-62.51B+17.73C-3.71AB-5.00AC+5.13BC-25.69A2-37.08B2-23.93C2；表2為該模型的可信度分析結果：其決定系數R2= 0.996 7，F值為235.60（P<0.000 1），說明所構建模型存在顯著性差異，單因素和雙因素（AB、AC和BC）均對產物轉化率有顯著的影響。圖3是三因素對脯氨酸羥化酶轉化率交互影響效應分析立體圖，通過嶺嵴分析，轉化反應的最適pH值為6.6，溫度為27℃，轉速為152 r/min。

為了驗證預測值以確定最優條件，采用上述最優條件進行驗證，重復3次所得的產物轉化率都達到了100%，說明響應面法獲得的模型與實際數據擬合度好。

3 討論

L-羥脯氨酸在醫藥、生化、美容業等方面有著較為廣泛應用，市場需求逐年上升，因此，L-羥脯氨酸生產工藝的開發受到科研工作者的關注。綜合考慮環境污染、產品純度和生產成本等因素的影響，采用生物轉化法生產L-羥脯氨酸無疑是較為理想的方法之一。

圖2 轉化反應條件優化

目前國內外主要采用指孢囊菌RH1來源的脯氨酸羥化酶催化L-脯氨酸產生L-羥脯氨酸，由于該基因GC含量過高，該酶在工業生產中的應用受到很大影響［5，7］。針對這個問題，國內外科研工作者進行了廣泛而深入的探究。Klein等［5］通過分子伴侶GroEL/GroES促進了酶蛋白P4hy的可溶性表達，以所構建的重組菌為催化劑，催化反應72 h后L-羥脯氨酸的轉化率為63%。劉合棟等［16］采用高頻密碼子替換、調整基因mRNA二級結構、引入色氨酸串聯啟動子及調整發酵補料策略等技術手段，最終使催化反應轉化率提高至81.1%。蔡萌萌等［17］通過探究發酵過程不同階段的溶氧水平對L-羥脯氨酸產量的影響，提出了分階段溶氧控制策略，最終使L-羥脯氨酸產量達45.3 g/L，糖酸轉化率達到20.7%。Liu等［18］采用增大溶氧量、添加蛋白酶降低發酵液中可溶性蛋白含量等手段優化發酵工藝，最終發酵獲得L-羥脯氨酸的含量為45.7 g/L，糖酸轉化率為18.1%。張琳琳等［8］通過優化基因p4hy的密碼子，降低其GC含量，并在分子伴侶質粒pG-KJE8的協同作用下提高了蛋白的可溶性表達，催化反應轉化率提高至72.8%。Wang等［19］通過基因挖掘技術從3株菌中篩選獲得了一個催化活性最好的脯氨酸羥化酶基因（alp4h），將該基因轉入L-脯氨酸生產菌株后，所構建的工程菌株產L-羥脯氨酸的產量為3.57 g/L，采用補料發酵處理36 h后L-羥脯氨酸含量為45.83 g/L；Zhang等［20］通過敲除大腸桿菌中L-脯氨酸代謝相關基因以及其他影響轉化反應的基因構建工程菌株，經過補料發酵法生產獲得L-羥脯氨酸濃度為31.0 g/L。這些結果說明了從影響酶蛋白催化反應的內在因素和外在因素進行優化或調控在一定程度上提高脯氨酸羥化酶的反應產物轉化率，具有較好的應用開發潛力；不足的是上述研究普遍存在反應轉化率低、反應終產物成分復雜等不利因素。

表1 轉化反應溫度、pH和振蕩速度三因素試驗設計及結果

表2 轉化反應溫度、pH和振蕩速度三因素試驗模型的可信度分析

圖3 產物轉化率與轉化反應溫度（A）、pH（B）和振蕩速度（C）的響應面圖

為了進一步提高酶蛋白P4hy的催化反應轉化率，降低生產成本，本實驗以張琳琳等［8］的實驗結果為基礎，以影響催化反應的外在因素為研究對象，通過單一因素優化法初步篩選獲得了轉化反應的最佳條件：蛋白表達最適誘導溫度為28℃，IPTG濃度為0.2 mmol/L；轉化反應最適溫度為28℃，緩沖液為MES（120 mmol/L，pH 6.5-7.0），L-脯氨酸與 α-酮戊二酸濃度均為200 mmol/L（1∶1），表面活性劑Nonidet P-40的濃度為1.5%。隨后，以單因素分析所得的最佳優化條件作為Box-Benhnken實驗設計的中心點，對影響轉化反應的因素做進一步優化，通過Design Expert 7.0.3統計軟件預測了影響轉化反應三因素的最適條件：轉化反應溫度為27℃，振蕩速率為152 r/min，轉化反應液pH值為6.6。驗證結果表明，在預測的最佳條件下，轉化反應進行48 h后即可將反應底物L-脯氨酸全部轉化為L-羥脯氨酸，產物轉化率達100%，實現了產物的高效轉化。

4 結論

通過單一因素優化法初篩、響應面法預測和實驗驗證，確定了最佳蛋白表達條件和催化反應條件，實現了在48 h內將反應底物L-脯氨酸全部轉化為L-羥脯氨酸（100%），確保了產物L-羥脯氨酸的高效轉化，同時也消除了反應底物L-脯氨酸對產物分離純化造成的干擾問題，為該產品的工業化生產奠定了良好的實驗基礎。