碘對大鼠甲狀腺BRAF基因甲基化的影響

吳 翌，許 敏，夏同佳，趙曉彤，王佑民，鄧大同

碘是維持人體正常甲狀腺功能的必需元素，與甲狀腺功能異常、自身免疫性甲狀腺炎、甲狀腺腫大、甲狀腺結節和甲狀腺腫瘤的發生發展有關，已有文獻[1-2]證實甲狀腺結節和甲狀腺腫瘤的發生與鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(v-raf mourine sarcoma viral oncogene homolog B1, B-raf)基因密切相關。甲狀腺疾病是常見的內分泌疾病，2014年我國有超過2億的甲狀腺疾病病人，并且其患病率呈現逐年上升的趨勢[3]。BRAF作為癌基因，其基因定位于人常染色體7q34 位點，對細胞周期有調控作用，與甲狀腺腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移、復發和預后密切相關[4-5]。碘作為環境因素,是否通過DNA甲基化機制影響BRAF基因表達尚不清楚。該研究通過建立不同碘營養狀態的動物模型，探討碘對大鼠BRAF基因甲基化和蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 不同碘營養水平大鼠模型構建動物購于安徽醫科大學實驗動物中心(安徽省實驗動物質量合格證：NO.340000200001326)的遠交封閉群SPF級SD大鼠，35～42 d，雌性，40只，體質量150～170 g，隨機均分為5組，分別為低碘組(LI組)、適碘組(NI組)、5倍高碘組(5HI組)、10倍高碘組(10HI組)、20倍高碘組(20HI組)。在安徽醫科大學動物實驗中心喂養，每籠4只，共10籠。實驗室溫度(22±2)℃，12 h晝夜交替，所有動物每日進食量限制20 g/d、飲水量20 ml/d。整個實驗過程均遵循“安徽醫科大學實驗用動物管理和使用指南”。5組大鼠均予以低碘飼料和混有碘化鉀的去離子水喂養，每只大鼠每日的總攝碘量為:LI組<1.00 μg;NI組6.15 μg;5HI組30.75 μg；10HI組61.50 μg；20HI組123.00 μg，5組SD大鼠的每日攝碘量(見表1)。每月使用代謝籠留取一次SD大鼠24 h尿液，由安徽省疾病控制中心使用ICP-MS(電感耦合等離子體質譜法)測定尿碘水平，結果顯示尿碘與給碘劑量呈正相關，提示造模成功。喂養3個月后處死大鼠，留取血液和甲狀腺組織標本，甲狀腺組織稱干重后迅速置于液氮中保存備用。

1.2 方法

1.2.1甲狀腺激素測定 血清游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)、游離甲狀腺素(free thyroxine，FT4)、促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)由安徽醫科大學第一附屬醫院內分泌實驗室釆用化學發光技術的競爭免疫法(美國西門子公司試劑盒)測定，應用德國西門子醫學診斷有限公司化學免疫分析儀(型號: ADVIA centaur XP)。

1.2.2甲基化 采用BSP法檢測，使用天根生化科技(北京)有限公司的組織DNA提取試劑盒, 按照說明書的步驟提取甲狀腺組織DNA。按DNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒使用說明書操作，進行DNA的亞硫酸氫鈉修飾及純化回收。DNA 亞硫酸氫鹽修飾試劑盒購自德國QIAGEN 公司；組織基因組提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自于天根生化科技(北京)有限公司。使用生物信息學在線網站MethPrimer對BRAF基因啟動子區域CpG島進行分析，經預測，發現BRAF基因啟動子區域具有1個CpG島，長度為444 bp。根據BRAF基因序列設計CpG島引物，F：5′-GAGGGTGGTTGGAGGAGAAGGAATATTTT-3′，R：5′-CCATTAAACAAAACCTATCCCTATT-3′；引物由華大基因科技有限公司合成 。擴增條件為95 ℃預變性10 min，40個熱循環(94 ℃、30 s，退火30 s，72 ℃、40 s), 72 ℃延伸5 min。將目標片段割膠純化。PCR 產物純化后連接克隆載體，采用Generay的PGH(Lot：GV0108)作為載體，XL10-Gold 感受態進行轉化、復蘇和涂板。挑取質粒送北京六合華大基因科技有限公司測序，使用BiQ Analyzer v2.0對測序的結果進行對比和甲基化分析。

1.2.3免疫組化 免疫組化操作步驟如下：① 烤片：65 ℃、1 h；② 脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ 15 min-二甲苯Ⅱ 15 min-二甲苯Ⅲ 15 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-85%酒精5 min-75%酒精5 min；③ 抗原修復：組織切片置于枸櫞酸緩沖液中進行微波修復；④ 阻斷內源性過氧化物酶：切片放入3%雙氧水溶液中孵育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min；⑤ 10%山羊血清封閉：孵育30 min；⑥ 加一抗(1 ∶100)：切片平放于濕盒內4 ℃孵育過夜；⑦ 室溫復溫1 h；PBS沖洗3次，每次5 min；⑧ 加二抗：室溫孵育50 min，PBS沖洗3次，每次3 min；⑨ 滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間、蘇木精復染、脫水封片；⑩顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。石蠟切片免疫組化結果判讀：蘇木精染細胞核為藍色，DAB顯出的陽性表達為棕黃色。使用Image Pro Plus圖像軟件分析，分別計算面積、累積吸光度(integrated optical density,IOD)、吸光度差值。

2 結果

2.1 每日碘攝入量與尿碘5組大鼠尿碘中位數與碘攝入量呈正相關，提示造模成功，但是，與NI組相比，5HI、10HI、20HI組尿碘中位數并未達到相應的倍數差。見表1。

2.2 各組血清甲狀腺激素和TSH水平在5組大鼠中，NI組的血清FT3最高，LI組和各HI組血清FT3 濃度較低，差異有統計學意義(P<0.05)；但LI組與各HI組比較，血清FT3水平無明顯差異。與NI組比較，LI組和各HI組血清FT4略增高，但差異無統計學意義(P>0.05)；大鼠血清 TSH 各組間比較5組的血清TSH水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 甲基化分析生物信息學在線網站MethPrimer對基因啟動子區域CpG島進行分析，經預測發現BRAF基因啟動子區域具有1個CpG島，長度為444 bp。統計分析以低碘組甲基化頻率及位點數為最高，但經單因素方差分析，非參數檢驗(K-W檢驗)和卡方檢驗比較，5組大鼠甲基化差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表1 5組大鼠尿碘檢測情況

表2 各組大鼠血清甲狀腺激素和TSH水平比較

與NI組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.4 免疫組化分析5組大鼠甲狀腺BRAF免疫組化表達(圖1)。經單因素方差分析，5組間AREA、IOD、吸光度差值比較，LI組、NI組和各HI組甲狀腺組織中BRAF表達逐漸增高，差異有統計學意義(P<0.05)(表4、圖2)。經兩兩比較(LSD法)，與NI組比較，LI組甲狀腺BRAF表達較低，各HI組表達較高，差異有統計學意義(P<0.05)；與5HI組比較，10NI組和20HI組表達較高，差異有統計學意義(P<0.05)(見表5)。

3 討論

全球除冰島外，世界各國都有不同程度的缺碘。我國是世界上缺碘相對嚴重的國家之一，碘缺乏病流行范圍廣，發病人數多，而且病情較重。為控制這一現狀，WHO 推薦在全球范圍內推行以食鹽加碘為主的策略。我國在1996年實行了全民食鹽加碘的干預措施，經過20多年的實施，國民碘營養狀況得到明顯改善，人體碘儲備增加，碘缺乏病得到了很好的控制[5-6]。但目前我國隨機人群甲狀腺結節檢出率高達19%～67%[7]；食鹽加碘前(1961～1994年) 甲狀腺惡性腫瘤檢出率為0.46%, 食鹽加碘后(1995～2000年)甲狀腺惡性腫瘤檢出率為0.69%,其中甲狀腺乳頭狀癌在食鹽加碘后所占構成比高于加碘前[8]。

表3 5組發生甲基化位點比例比較(n=8)

圖1 5組大鼠甲狀腺BRAF表達 DAB染色×400

表4 單因素方差分析5組間面積、IOD、吸光度差值(n=8)

圖2 5組大鼠甲狀腺BRAF蛋白表達量

A：免疫組化組間、面積比較；B：免疫組化組間IOD比較；C：免疫組化光密度差值比較；與NI組比較：*P<0.05

表5 5組間面積、IOD、吸光度兩兩比較(n=8)

續表

BRAF基因作為癌基因，與甲狀腺腫瘤的發生、侵襲、轉移和復發密切相關，其基因位于人體染色體7q34, 大小約190 ku , 含18個外顯子，有3 個保守區域，即CR1、CR2和CR3。 其中CR1、CR2位于氨基末端，并含有調節RA催化區域的部分，CR3是激酶區域。該基因至少含有7個轉錄區，能編碼多種蛋白質，其中包括全長約94 ku，有783個氨基酸殘基的B型有絲分裂原激活的蛋白激酶依賴性激酶，屬絲氨酸∕蘇氨酸蛋白激酶類[9-10]。BRAF基因突變位點大多位于第1 799位點腺嘌呤替代了胸腺嘧啶，導致激酶活性片段第15位外顯子上的 T1799A點突變(V600E)，BRAF中的纈氨酸(V)被谷氨酸(E)替代[11]，從而持續激活BRAF激酶，造成MAPK通路持續活化，細胞不斷分裂增殖，進而形成甲狀腺腫瘤。

碘作為環境因素，其攝取量的多少可能參與了甲狀腺疾病的發生。本實驗通過不同碘含量飲用水成功構建不同碘營養水平的大鼠模型，結果顯示NI組、LI組和各HI組僅血清FT3水平有統計學差異。BRAF是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，在MAP激酶通路的信號轉導中發揮作用，主要底物為MEK1和MEK2，其致癌作用是通過Ras-Raf-Mek-Erk通路激活所介導的[12-13]，BRAF高表達可能參與甲狀腺上皮細胞的過度增生。基因甲基化發生在CpG島上，CpG島是圍繞基因調控區聚集，從未影響基因自身的轉錄調控。本研究利用免疫組化技術發現隨著碘攝入量的增多，LI組到HI組面積、IOD、吸光度逐漸增高，差異有統計學意義，說明碘可以影響大鼠甲狀腺BRAF蛋白的表達，但碘對甲狀腺BRAF基因啟動子區域CpG島的影響在5組大鼠間未見異常。提示碘對甲狀腺BRAF蛋白表達的影響可能不是通過BRAF基因的甲基化途徑，而表觀遺傳學除DNA甲基化外，還有組蛋白修飾、非編碼RNA等途徑，所以，需進一步對其他途徑進行探索。