TIMP-4和MMP-2在胃癌中的表達

孔 晉,吳文涌, 吳正升

胃癌(gastric cancer，GC)是世界第五大常見的癌癥，近年來發病率在不斷上升[1]。胃癌預后較差，5年生存率低于30%，部分原因是腫瘤細胞的快速侵襲和轉移[2]。侵襲與轉移是惡性腫瘤的重要生物學行為之一，其過程包括細胞轉移相關基因基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinase family, MMPs)、金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP)等的失調。細胞外基質(extracellular matrix，ECM)蓄積是腫瘤侵襲和轉移的重要因素。ECM受MMPs及其內源性抑制劑TIMPs的調節。MMPs組織TIMP-4是一種抑制MMPs活性的蛋白質。研究[3]表明TIMP-4表達與神經膠質瘤的預后、分期及疾病進展相關。TIMP-4在胃癌中的表達情況及其與患者預后關系的研究較少。TIMP-4通過抑制 MMPs介導的活化來調節明膠酶A的活性。MMP-2是惡性腫瘤侵襲和轉移的標志，參與ECM和基底膜Ⅳ型膠原的降解，在細胞遷移過程中起重要作用[4]。因此該研究從蛋白水平探討胃癌中TIMP-4和MMP-2表達情況，并分析兩者之間關聯性，為研究GC 的發生、發展機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集安徽醫科大學第一附屬醫院2013年10月～11月通過手術切除經病理證實的、臨床病理資料完整的GC組織存檔蠟塊75例。所有患者術前均未接受過放療、化療或生物治療等干預措施。其中男 55例，女20例，年齡35～81(62±10.22)歲；腫瘤直徑≤5 cm 44例，>5 cm 31例；淋巴結轉移54例，無淋巴結轉移21例；按胃癌分化程度：中高分化腺癌30例，低分化腺癌45例；按第8版國際抗癌聯盟和美國癌癥聯合委員會胃癌TNM分期標準[5]：Ⅰ期+Ⅱ期36例，Ⅲ期+Ⅳ期39例。收集相應癌旁組織(距癌組織邊緣2 cm以上)存檔蠟塊42例。參與本次研究的所有患者均同意并簽署知情同意書。相關樣品的收集和處理都是在遵守《赫爾辛基宣言》[6]的情況下進行并經安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器兔抗人TIMP-4(12326-1-AP，工作濃度1 ∶100)多克隆抗體及鼠抗人MMP2(66366-1-1g，工作濃度1 ∶75)單克隆抗體均由美國Proteintech Group公司生產；即用型快速免疫組化MaxVisionTM檢測試劑盒(KIT5020)購自福州邁新公司；DAB顯色劑(ZLI9018)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；OlympusCX22生物顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 實驗方法所有收集的組織存檔蠟塊經4 μm厚連續切片，行免疫組織化學染色。染色結果經2名經驗豐富的病理科醫師采用雙盲原則評定。免疫組化染色采用EnVision法。主要步驟如下：4 μm厚的石蠟切片65 ℃烤片，脫蠟水化，經檸檬酸鈉緩沖液高壓加熱抗原修復，3% H2O2作用10 min阻斷內源性過氧化物酶的活性。一抗(MMP-2、TIMP-4)4 ℃過夜孵育，PBS清洗后每張切片滴加生物素標記的二抗工作液，37 ℃干燥箱孵育30 min，DAB顯色劑顯色，蘇木精復染，常規脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察染色情況，陽性對照使用MMP-2、TIMP-4表達良好的胃組織，PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判斷對TIMP-4和MMP-2的表達水平進行半定量的評估。顯微鏡下觀察切片，以細胞質內出現明顯的棕黃色顆粒為陽性。對陽性細胞進行染色程度的得分評判，同時對陽性細胞進行計數。將染色強度和陽性細胞百分比結合判斷TIMP-4和MMP-2蛋白免疫組化結果。結果判斷采用半定量積分法：① 著色強度打分：0分，細胞無著色；1分，細胞著色為淺黃色；2分，細胞著色為棕黃色；3分，細胞著色為棕褐色；染色強度需與背景著色相對比。② 根據陽性細胞所占百分比打分：0分，陰性；1分，陽性細胞≤10%；2分，陽性細胞>10%～50%；3分，陽性細胞>50%～75%；4分，陽性細胞>75%。按著色強度分值與陽性細胞百分比分值乘積結果將切片分為4個等級：“-”：0～2分；“+”：3～5分；“”： 6～8分；“”：9～12分；以≥3分判定為免疫反應陽性[7]。

1.5 Kaplan-Meier生存分析和臨床表達分析Kaplan-Meier plotter(http://kmplot.com/analysis/)是一個綜合的在線平臺，可基于10 293例癌癥樣品評估54 675個基因對生存的影響。本研究使用Kaplan-Meier繪圖儀評估TIMP-4和MMP-2的預后價值及其在胃癌患者中的表達。從TCGA數據庫獲得527例胃癌組織和349例癌旁組織中TIMP-4 mRNA表達數據；以及570例胃癌組織和306例匹配的癌旁正常組織中MMP-2 mRNA表達數據。

1.6 統計學處理采用SPSS 23.0軟件進行分析，各組間比較采用χ2檢驗，指標間的相關性分析采用Pearson相關分析。構建Kaplan-Meier曲線以確定患者總生存率(overall survival,OS)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TIMP-4和MMP-2蛋白在GC組織以及癌旁組織中的表達TIMP-4和 MMP-2和蛋白均定位于細胞質，蛋白陽性表達時染色呈棕黃色顆粒(圖1)。75例GC組織中，65例(86.67%)TIMP-4蛋白陽性表達，有68例(90.67%)MMP-2蛋白表達為陽性；而在42例癌旁組織中，僅22例(52.38%)TIMP-4陽性表達，23例(54.76%)MMP-2蛋白表達為陽性。TIMP-4蛋白與MMP-2蛋白在胃癌組織表達均較癌旁組織中高且差異均有統計學意義(P<0.001)(表1)。

圖1 胃癌組織與癌旁組織中TIMP-4和MMP-2免疫組化結果 En Vision法×200

2.2 TIMP-4和MMP-2蛋白在GC患者中的表達與相關臨床病理參數的關系在胃癌患者中，TIMP-4蛋白表達與性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、腫瘤分化程度及分期均無統計學意義(P>0.05)。MMP-2蛋白的高表達與淋巴結轉移及胃癌分期相關且差異有統計學意義(P<0.001)；但與性別、年齡、腫瘤大小以及分化程度無相關性，見表2。

表1 TIMP-4蛋白和MMP-2蛋白在胃癌組織和癌旁組織中的表達(n)

表2 TIMP-4和MMP-2蛋白表達和臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 GC組織中TIMP-4和MMP-2表達的相關性分析Pearson相關分析表明，在75例GC組織中TIMP-4和MMP-2表達水平呈正相關且有統計學意義(r=0.351,P<0.001)。

2.4 TIMP-4和MMP-2 Kaplan-Meier生存分析和臨床表達分析使用在線生物信息學工具Kaplan-Meier繪圖儀檢索，結果顯示TIMP-4、MMP-2高表達的胃癌患者OS降低(圖2)。

3 討論

根據世界衛生組織的數據，胃癌是全球最常見的第五種癌癥和第三大癌癥死亡原因[1-2]。在我國胃癌死亡率居全國第二，由于缺乏特異性的早期篩查和診斷方法，大量胃癌患者在初診時已進展到晚期，預后較差，5年生存率不超過25%[8]。胃癌作為最常見的惡性腫瘤之一，早期診斷和治療已成為一個亟待解決的問題。研究[9]表明幽門螺桿菌感染、細胞增殖與細胞周期功能障礙、血管生成細胞浸潤和轉移等一系列復雜的分子生物學過程參與了胃癌的發生發展。腫瘤侵襲和轉移是胃癌患者死亡的主要原因[10]。然而，胃癌轉移的機制尚不完全清楚。因此，有必要對胃癌轉移等生物學行為進行研究，為制定最有效的個體化治療方案，提高臨床療效提供理論依據。

TIMP-4是一種抑制金屬蛋白酶活性的蛋白質，通過有效抑制MT1MMP介導的活化來調節明膠酶A的活性。有研究[11]表明TIMP-4在乳腺癌中高表達能夠抑制腫瘤生長、在子宮內膜癌中TIMP-4過表達與侵襲有關、而在宮頸癌中TIMP-4高表達與疾病晚期相關。然而TIMP-4在胃癌中的作用仍未見報道。蛋白水解酶在細胞外基質的降解過程中起著關鍵的作用，MMPs是一種重要的蛋白水解酶[12-13]。MMP-2作為MMPs家族的重要成員，在胃癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤中高表達，其表達與腫瘤分期、淋巴浸潤、淋巴結轉移及復發密切相關[14-15]。

圖2 基于TIMP-4、MMP-2的總生存期Kaplan-Meier生存曲線

本研究分析了75例胃癌組織及42例癌旁組織中MMP-2蛋白和TIMP-4蛋白表達水平。結果顯示90.67%的胃癌組織中MMP-2蛋白陽性表達，并且MMP-2蛋白高表達與腫瘤淋巴結轉移顯著相關(P<0.001),同時與胃癌分期存在一定統計學關聯，這與前人的研究[9]是一致的，說明MMP-2可以作為預測胃癌預后的潛在標志物；75例胃癌組織中TIMP-4蛋白的陽性表達率為86.67%，高于癌旁組織，但與胃癌轉移、分期和分化程度等無明顯統計學關聯。說明TIMP-4可能作為胃癌早期診斷的標志物。Spearman相關性分析顯示，胃癌組織中MMP-2蛋白表達水平與TIMP-4蛋白表達水平有統計學相關性且呈正相關關系(r=0.351,P<0.001)，說明聯合檢測 MMP-2與TIMP-4這兩項指標更有助于胃癌患者的診斷及預后評估。同時Kaplan-Meier生存分析驗證了腫瘤患者中MMP-2、TIMP-4高表達，并預示著更短的總生存期(P<0.05)。

綜上，MMP-2與TIMP-4在胃癌組織中高表達，且其高表達均提示胃癌患者預后較差，可作為胃癌診斷和預后的潛在標志物。