FTY-720通過S1P1受體調節哮喘小鼠氣道炎癥①

劉函曄 劉衛東 陳正愛 高 歌 延光海 張婧瑤 崔 弘

(延邊大學基礎醫學院,延吉 133002)

近年哮喘的發病率和死亡率在全球范圍內呈上升趨勢，威脅世界3億人口，主要特征為持續氣道炎癥和氣道壁重塑體積為上皮細胞脫落、杯狀細胞增生、氣道平滑肌束增生和肥大、基底膜增厚和血管密度增加等病理變化。變應原反復刺激產生的炎癥通過加重氣道平滑肌病理變化加重哮喘，與慢性阻塞性肺疾病(COPD)相似，部分哮喘患者由于氣道重塑、黏膜及平滑肌增厚引起氣流受限導致死亡[1]。

鞘氨醇1-磷酸(sphingosine-1-phosphate，S1P)通過5種G蛋白偶聯受體S1P1-5參與細胞增殖、凋亡、淋巴細胞流出、內皮屏障功能、血管生成和炎癥等細胞過程。研究表明S1P是肥大細胞的鞘脂代謝產物，誘導肥大細胞活化，肥大細胞激活后脫顆粒并釋放生物活性物質，導致哮喘[2]。另外，S1P是淋巴細胞從次級淋巴器官進入體循環的主要調節劑，隨著哮喘病程延長，血清S1P水平顯著升高[3]。

FTY-720是治療多發性硬化癥的藥物，是S1P受體激動劑，可與除S1PR2外的所有S1PRs結合[4]。FTY-720磷酸化后結構與S1P結構相似，與S1P競爭結合S1P1受體，阻斷S1P1下游促炎通路，但S1P對哮喘的作用機制尚未明確。本研究以OVA誘導小鼠哮喘模型，探究FTY-720對S1P1的作用及其在哮喘小鼠中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器 OVA、氫氧化鋁混懸液(美國Sigma公司)，IL-4、IL-5、IgE(美國Invitrogen公司),全蛋白提取試劑盒、AB-PAS染色試劑盒(北京索萊寶公司)，S1P1、Wnt1、Phospho-RAC1-S71(美國Santa Cruz公司)，β-actin、P38-MAPK(美國Cell Signaling公司)，FTY-720(美國Cell Signaling公司)；402型超聲霧化器(上海四菱醫療器械廠)，RT-2100C酶聯免疫檢測儀(美國Rayto公司)，電泳儀、Western blot轉膜儀和Gel Doc凝膠成像儀(Bio Rad公司)。

1.1.2實驗動物 30只雄性BALB/c小鼠隨機分為3組:正常組、模型組、治療組，每組10只，由延邊大學醫學部實驗動物中心提供。

1.2方法

1.2.1哮喘模型建立 除正常組外，模型組和治療組第0、7、14天腹腔注射0.05 g OVA和0.56 ml Al(OH)3溶于200 μl生理鹽水。第21天起，將0.1 g OVA溶于10 ml生理鹽水中激發30 min，共激發5天。第19天起連續給藥7 d，第21天至第25天在激發前30 min腹腔注射FTY-720(2 mg/kg)200 μl。

1.2.2樣本獲取與處理 最后一次激發24 h后，乙醚麻醉小鼠并眼球取血，室溫放置3 h后4℃1 500 r/min 離心15 min，取上清，-80℃儲存待用。以生理鹽水1 ml進行肺部灌洗，取支氣管肺泡灌洗液(0.8 ml以上為合格)。取小鼠左肺于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片；右肺進行勻漿處理，并進行蛋白提取，-80℃儲存待用。

1.2.3HE、AB-PAS染色 將組織石蠟塊切成4 μm 切片，脫蠟處理進行常規HE染色；中性樹膠封片后于光學顯微鏡下觀察炎癥細胞浸潤及肺組織病理學變化。AB-PAS染色，觀察肺組織氣管周圍杯狀細胞含量變化。HE染色分析肺組織病理學變化。

1.2.4血清IgE含量檢測 血清室溫平衡2 h，ELISA檢測版室溫平衡30 min后每孔加入檢測樣本和標準試劑，加入檢測試劑檢測。加入TMB顯色液，100 μl/孔避光30 min，加入終止液。酶標儀于562 nm處檢測吸光度，繪制標準曲線，計算濃度。

1.2.5BALF中IL-1、IL-4、IL-5檢測 眼球取血后處死小鼠，氣管插管注入1 ml生理鹽水，輕壓小鼠胸部，回吸灌洗液(>80%為合格)，4℃ 1 500 r/min離心5 min，取上清，ELISA檢測BALF中IL-1、IL-4、IL-5含量。

1.2.6肺組織中S1P1、Wnt1、p-RAC1、p-P38-MAPK含量檢測 肺組織勻漿后提取蛋白并進行Western blot實驗，對肺組織中S1P1、Wnt1、p-RAC1、p-P38-MAPK等蛋白進行半定量檢測，以β-actin為內參。

2 結果

2.1FTY-720抑制OVA誘導的小鼠哮喘 與正常組相比，模型組小鼠氣管周圍有明顯的炎癥細胞浸潤，氣管壁明顯變厚；FTY-720處理后，哮喘小鼠病理狀況明顯改善。AB-PAS染色后，模型組小鼠氣管壁上有明顯杯狀細胞增生，FTY-720處理后杯狀細胞數量顯著減少。說明FTY-720抑制OVA誘導的小鼠哮喘的發生發展(圖1)。

2.2FTY-720降低哮喘小鼠BALF中炎癥細胞含量 模型組總細胞數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數量明顯升高，FTY-720處理后，小鼠BALF中OVA誘導增多的總細胞數、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞數量顯著降低(圖2)。

圖1 各組小鼠肺組織病理學染色結果(×200)Fig.1 Pathological staining results of lung tissue in each group of mice(×200)

圖2 BALF中炎癥細胞數量Fig.2 Numbers of inflammatory cells in BALF

圖3 FTY-720對BALF中炎癥因子水平及血清IgE含量的影響Fig.3 Effect of FTY-720 on inflammatory factors in BALF and IgE content in serum

圖4 FTY-720對S1P1蛋白表達的影響Fig.4 Effect of FTY-720 on S1P1 protein expressions

圖5 FTY-720對WNT1，RAC1，P38-MAPK蛋白表達的影響Fig.5 Effect of FTY-720 on expressions of WNT1,RAC1 and P38-MAPK proteins

2.3FTY-720降低BALF中炎癥因子及血清IgE含量 與對照組相比，OVA誘導的哮喘小鼠BALF中IL-1、IL-4、IL-5含量明顯升高，FTY-720處理后，細胞因子含量顯著降低。OVA誘導提高小鼠血清IgE含量，FTY-720處理后IgE水平顯著降低(圖3)。

2.4FTY-720競爭性抑制S1P1表達 結果顯示，給予FTY-720后S1P1表達降低，表明FTY-720競爭性拮抗S1P1受體表達(圖4)。

2.5FTY-720抑制WNT1、RAC1、P38-MAPK的磷酸化 OVA誘導增加小鼠肺組織WNT1、RAC1、P38-MAPK磷酸化水平，FTY-720處理后WNT1、RAC1、P38-MAPK磷酸化水平顯著降低(圖5)。

3 討論

哮喘由遺傳因素與環境因素(如空氣過敏原和呼吸道病毒)共同引起。在氣道內腔內，過敏原可被樹突狀細胞捕獲，處理抗原分子，并將其呈現為輔助T(Th0)細胞。過敏原特異性激活Th2細胞產生IL-4和IL-13，促進B細胞產生IgE抗體；釋放IL-5誘導嗜酸性粒細胞成熟[5]。除Th2細胞外，IL-9釋放的Th9細胞被激活后導致肥大細胞生長和募集，在IgE依賴性脫粒釋放中發揮預形成作用和合成新介質。多種介質、細胞因子、轉化生長因子等作用于慢性哮喘細胞，產生作用物影響包括上皮在內的氣道結構細胞(成纖維細胞、平滑肌細胞和血管內皮細胞)的功能和增殖速度[6]。

Wnt家族由多種糖蛋白組成，具有高度保守的半胱氨酸殘基。Wnt 信號途徑在細胞間呈現自分泌和旁分泌兩種信號傳導方式，同S1P生物學功能相似，Wnt/β-catenin信號通路參與細胞增殖、形態發生和發育等多種生物學活動[7]。在肺部疾病中Wnt可激活TGF-β通路，引發肺纖維化[8]。研究表明WNT5A通過RAC和JNK通過不依賴于增殖的WNT信號誘導形成延長的淋巴網絡，參與炎癥反應[9]。RAC1在哮喘中起重要作用，敲低RAC1導致抗炎因子水平下降，影響上皮細胞的吞噬作用。P38-MAPK是MAPKs的亞群，與JNK通路相似，可被促炎因子如TNFα、IL-1等激活，或被脂多糖及G+細菌細胞壁成分激活。研究表明p38-MAPK參與哮喘炎癥表達，可通過p38-MAPK/PI3K信號通路被抑制[10,11]。

盡管S1P與WNT等信號通路均有研究，但在哮喘中S1P與WNT的作用機制尚未明確。本研究通過給予FTY-720，發現S1P1受體表達可抑制哮喘炎癥及改善病理狀態；FTY-720處理后WNT、RAC1等蛋白含量明顯減少，證明S1P可通過S1P1受體調控WNT通路，并通過抑制RAC1緩解哮喘。進一步檢測MAPK通路中的P38-MAPK，P38-MAPK含量減少并可進一步激活NF-κB等通路，進一步抑制哮喘的炎癥反應。

綜上所述，FTY-720可抑制WNT通路，并通過抑制S1P1/WNT1/RAC1/P38-MAPK通路改善哮喘的炎癥反應，改善肺組織病理變化。