CD4陽性T細胞分泌的Bcl2L12蛋白在小兒潰瘍性結腸炎中促進Th2細胞活化對疾病進展的影響

趙玉霞 劉迎春 張細元 梅 紅

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院消化內科，武漢 430016)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病的一種類型，近年來，國內兒童UC的患病率逐年上升，引起兒科臨床的高度重視。UC的發病機制目前尚不清楚，病理學研究發現結腸黏膜中單核細胞深度浸潤，Th2細胞分泌過量的促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、IL-17、IL-4、IL-5 和IL-13等，與UC的嚴重程度密切相關[1]。免疫失調是炎癥性腸病的重要致病因素[2]，其中Th2或Th17活化在UC的發病機制中起關鍵性作用[3]。但其在腸道中介導Th2活化的機制目前尚未清楚。有研究發現Bcl2樣蛋白12(Bcl2 like protein 12，Bcl2L12)在免疫失調發病過程中起到重要作用[4]。Bcl2L12屬于Bcl2家族，是抗凋亡分子之一[5]，能夠抑制P53并促進細胞存活[6]。但Bcl2L12蛋白在小兒UC發病中的作用目前尚無報道。因此本研究主要探討CD4+T細胞分泌的Bcl2L12在介導Th2活化過程中的機制。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 按照《兒童炎癥性腸病診斷規范共識意見》診斷標準[7]，納入2015年1月～2017年12月于我院初診的20例UC患兒，并以同期20例性別、年齡匹配的健康兒童作為對照組。UC組和對照組均符合以下標準：①無自身免疫性疾病；②近3個月內無感染史；③近3月內無激素、免疫抑制劑及生物制劑用藥史。本研究經本院倫理委員會審核通過，所有患兒及對照組親屬知情同意。UC患兒及對照組的一般資料見表1。

表1 UC組和健康對照組的臨床資料

1.1.2實驗動物 CD4+T細胞中Bcl2L12特異性敲除小鼠(Bcl2L12-KO)及其對照C57BL/6J野生型小鼠(WT)均購自武漢大學實驗動物中心，并飼養于無菌動物飼養室。

1.2方法

1.2.1外周血標本收集及血清、PBMC分離 在無菌條件下抽取外周靜脈血10 ml，其中2 ml置于離心管中，靜置30 min后以500 r/min離心5 min，取上清儲存于-80℃冰箱中；另外8 ml經肝素抗凝后于2 h內通過密度梯度離心法收集外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。

1.2.2血清炎癥因子檢測 ELISA法分別檢測的血清中Th2細胞活化因子IL-4、IL-5和IL-13及Bcl2L12水平(試劑盒購自BD公司)。

1.2.3流式細胞術檢測Th2細胞 在PBMC懸液中加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗CD4抗體和PE標記的抗IL-4抗體測定Th2細胞，CD4+IL-4+雙陽性細胞即為Th2細胞。

1.2.4UC造模 取4周齡WT和Bcl2L12-KO各20只，每組選取10只小鼠自由飲用3%的硫酸葡聚糖(dextran sulphate sodium，DSS)連續7 d，作為UC模型組；其余10只小鼠正常飲用水，無DSS添加，作為對照組。第8天時處死小鼠，進行后續實驗。

1.2.5小鼠體重測定 在造模期間，每日觀察小鼠的精神狀態、毛色、進食及糞便情況，并記錄體重。

1.2.6結腸長度測定 實驗第8天，處死小鼠后取結腸至肛門直腸段，測量并記錄自然長度。

1.2.7結腸HE染色及病變評分 取小鼠結腸組織，用生理鹽水沖洗后，置于4%多聚甲醛中，于室溫下固定12 h以上，經脫水、石蠟包埋后連續切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色。結腸組織的炎癥病理評分標準如下：腸壁炎癥嚴重程度分為輕度1分、中度2分、重度3分；病變嚴重程度分為病變位于黏膜層1分、黏膜和黏膜下層2分、透壁性損害3分；隱窩損害程度分為輕度1分、中度2分、隱窩缺失但上皮完整3分、隱窩表面上皮都缺失4分。將上述3項指標相加即為最后得分。

1.2.8血清炎癥因子和Th2細胞比例測定 血清炎癥因子測定同1.2.2；外周血PBMC中Th2細胞比例測定同1.2.3。

1.2.9結腸組織中Th2凋亡細胞檢測 取病變所在部位結腸，經膠原酶Ⅳ水解單細胞化后，加入FITC標記的抗CD4抗體和PE標記的抗IL-4抗體測定Th2細胞，APC標記的Annexin V和PI染料，通過流式細胞術檢測病變結腸組織中Th2凋亡細胞(以Annexin V+PI-為特征)占總Th2細胞的比例。

1.2.10Western blot檢測Th2細胞中Bcl2L12蛋白水平 分離Bcl2L12-KO和WT小鼠脾臟中的Th2細胞，加入細胞裂解液，離心10 min后取上清，沸水浴3 min使蛋白充分變性，Western blot法檢測Bcl2l12-KO和WT小鼠Th2細胞中Bcl2L12蛋白的表達，從而驗證Bcl2L12敲除效率。以β-actin作為參照。

2 結果

2.1UC患兒血清中Th2相關炎癥因子水平 UC患兒血清中IL-4水平[(20.67±3.55)μg/ml vs (4.78±1.38)μg/ml，P<0.001]、IL-5水平[6.95 μg/ml vs (2.71±1.27)μg/ml，P<0.05]和IL-13水平[(49.73±13.57)μg/ml vs (21.50±4.81)μg/ml，P<0.01]均明顯高于對照組(圖1A-C)。通過流式細胞數分析外周PBMC中Th2細胞比例發現，UC患兒PBMC中Th2細胞比例顯著高于對照組[(4.39±2.04)% vs (1.05±0.62)%,P<0.01](圖1D)。

2.2UC患兒血清BCL2L12蛋白水平 UC患兒血清中BCL2L12蛋白水平顯著高于對照組[(46.04±13.42)μg/ml vs (12.44±4.88)μg/ml，P<0.01](圖1E)。

圖1 UC患兒與對照組的血清Th2相關炎癥因子及BCL2L12蛋白水平比較Fig.1 Serum Th2-related inflammatory factors and BCL2L12 protein levels in children with UC and controls

2.3Bcl2L12對UC進展的影響 Bcl2L12-KO小鼠的外周血Th2細胞不表達Bcl2L12蛋白(圖2A)。通過DSS誘導UC后發現，Bcl2L12-KO小鼠的結腸炎癥程度弱于WT小鼠(圖2B)。進一步通過炎癥評分證實Bcl2L12-KO小鼠經DSS誘導后的炎癥評分顯著低于WT小鼠[(2.4±0.8 )vs (8.4±1.4)，P<0.01](圖2C)。此外，Bcl2L12-KO小鼠在DSS誘導后體重降低程度明顯低于WT小鼠(P<0.01)(圖2D)，且結腸長度長于WT小鼠(P<0.01)(圖2E)。

2.4Bcl2L12對Th2細胞炎癥因子分泌的影響 Bcl2L12-KO小鼠經DSS誘導后，外周血中的Th2細胞比例顯著低于WT小鼠[(10.1±2.9)% vs (23.2±3.8)%，P<0.01](圖3A)。 同時， Bcl2L12-KO小鼠血清中IL-4[(5.39±1.42)μg/ml vs (18.44±4.21)μg/ml，P<0.001]、IL-5[(2.41±0.92)μg/ml vs (8.73±1.40)μg/ml，P<0.01]、IL-13[(12.59±4.31)μg/ml vs (43.52±12.40)μg/ml，P<0.05]和Bcl2L12蛋白水平[(0.32±0.19)μg/ml vs (58.21±12.42)μg/ml，P<0.001]均顯著低于WT小鼠(圖3B～E)。未經DSS誘導的Bcl2L12-KO和WT小鼠外周血中Th2細胞比例、IL-4、IL-5、IL-13水平無統計學差異(P>0.05)(圖3A～D)。

圖2 Bcl2L12-KO與WT小鼠的UC造模Fig.2 UC model in Bcl2L12-KO and WT mice

圖3 Bcl2L12-KO與WT小鼠的血清Th2相關炎癥因子及BCl2L12蛋白水平比較Fig.3 Comparison of serum Th2-related inflammatory factors and BCl2L12 protein levels in Bcl2L12-KO and WT mice

圖4 Bcl2l12-KO與WT小鼠結腸組織中Th2細胞凋亡情況Fig.4 Apoptosis of Th2 cells in colon tissues of Bcl2l12-KO and WT mice

2.5Bcl2L12對Th2細胞凋亡的影響 經DSS誘導后，Bcl2L12-KO小鼠的Th2凋亡細胞比例顯著高于WT小鼠[(29.1±4.3)% vs (8.4±2.3)%，P<0.001]，但未經DSS誘導的Bcl2L12-KO和WT小鼠的結腸組織中Th2凋亡細胞比例無統計學差異(圖4)。

3 討論

UC是發生于結腸黏膜中的慢性炎癥，其致病因素目前仍無定論。有研究發現結腸中對食物過敏源的偏態反應，而這種反應被認為是食物蛋白誘導的腸道炎癥綜合征或非IgE介導的食物過敏[8]。也有研究表明，合并有IgE介導的食物過敏的UC患者對過敏原特異性免疫治療反應良好[9]。而目前的理論認為Th2偏向性炎癥反應是過敏性疾病的主要特征之一。而本研究也發現了UC患兒外周血中Th2細胞比例增多，提示了UC患兒處于Th2偏向性炎癥反應狀態。

Th2活化介導的炎癥反應以Th2細胞深度浸潤和局部組織中高水平的Th2細胞因子的分泌為主要特征，包括IL-4、IL-5和IL-13，其中IL-4是Th2細胞分子的特征性因子[10]。IL-4介導B細胞中的IgE同型轉換而促進IgE的分泌[11]。目前有多項研究探討了Th2炎癥反應在UC發病機制中的作用。Melgar等[12]發現UC患者的結腸黏膜中Th2細胞比例降低，但Rosen等[13]則發現UC患者的血清中Th2細胞因子(IL-5和IL-13)的水平顯著升高，并且與UC的結腸黏膜愈合密切相關。盡管目前認為Th2細胞因子對機體本身具有適當的保護性作用，但Th2細胞因子的過量分泌也將介導多種疾病的發生和進展[14]。本研究也發現UC患兒血清Th2細胞因子水平顯著高于對照組兒童，這與Rosen等[13]的結論一致。

盡管Th2細胞因子參與慢性炎癥疾病的發生已被充分認可，但驅動Th2細胞因子過量分泌的機制目前尚不清楚。本研究結果表明，CD4+T細胞合成并分泌的Bcl2L12蛋白在介導Th2偏向性的炎癥反應中起重要作用，提示Bcl2L12蛋白與UC的發生相關。Bcl2L12是BCL2家族成員之一，參與細胞凋亡的調節。早期研究表明膠質瘤細胞、肝臟和血管內皮細胞等均可合成并分泌Bcl2L12蛋白[15]。本研究發現CD4+T細胞可以合成和釋放Bcl2L12蛋白。Bcl2L12的表達能夠抑制抑癌基因P53、胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7的表達從而抑制細胞凋亡[16]。本研究發現Bcl2L12敲除小鼠在UC造模后結腸組織中凋亡的Th2細胞比例顯著低于野生型小鼠，這也提示了Bcl2L12蛋白在抑制Th2細胞凋亡方面的作用。本研究還發現Bcl2L12敲除小鼠經UC造模后，其體重下降程度、結腸縮短程度均明顯低于野生型小鼠，且Bcl2L12敲除小鼠結腸組織的炎癥嚴重程度和炎癥評分均明顯低于野生型小鼠，血清中Th2細胞因子水平和Th2細胞比例也顯著低于野生型小鼠。由于本研究采用的是CD4+T特異條件性Bcl2L12敲除的小鼠模型，直接提示了CD4+T細胞分泌的Bcl2L12在參與Th2細胞活化從而促進UC進展中的作用。

綜上所述，本研究證實了小兒UC患兒血清中Bcl2L12和Th2細胞因子水平顯著升高，處于Th2偏向性炎癥反應狀態。通過小鼠模型證實了CD4+T細胞分泌的Bcl2L12蛋白能夠抑制Th2細胞的凋亡，從而促進Th2細胞的活化、刺激Th2細胞因子的分泌并促進UC疾病的進展，為UC的治療提供新的靶點。