綿羊紅細胞溶血素制備方法的改進及其在教學實驗中的應用①

孫元杰 國 航 唐 康 馬 櫻 張春梅

(空軍軍醫大學基礎醫學院免疫學教研室,西安 710032)

在醫學免疫學實驗教學中，溶血素參與的溶血實驗常作為補體系統中起到重要生物學功能的溶細胞的一個教學實驗。國內有教學組用不同動物紅細胞制備溶血素，并對溶血實驗的效果進行了對比[1,2]。本教研室曾用全細胞加佐劑免疫小鼠的方法，用免疫組織化學方法篩選針對腫瘤相關抗原的抗體，發現全細胞加佐劑組篩選到陽性抗體的比率明顯增加。據此，本文嘗試用綿羊紅細胞(sheep red blood cell，SRBC)加佐劑方法免疫家兔制備溶血素，發現其ELISA效價和溶血效價均明顯高于常規SRBC經耳緣靜脈免疫組，并在教學實驗中取得滿意效果。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要材料與試劑 酶標板購自康寧公司；酶標儀購自伯樂公司；四甲基聯苯胺(TMB)顯色劑購自碧云天生物公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自Sigma公司。

1.1.2實驗動物 實驗用動物均由空軍軍醫大學實驗動物中心提供。新西蘭家兔4只,雌性,體重2～3 kg/只，隨機分為A、B兩組,每組2只。豚鼠心臟取血分離新鮮血清，將3只豚鼠血清混合作為補體來源。

1.2方法

1.2.1SRBC懸液制備 選用健康綿羊，頸靜脈無菌取血，將羊血放入有玻璃珠的無菌三角燒瓶中，同一方向均勻用力搖動，充分混合，去除纖維蛋白,直至血液不會凝固。將抗凝血置離心管中，2 000 r/min，離心5 min，用生理鹽水洗滌5次后,配成20%或10% SRBC懸液,置4℃冰箱保存備用。

1.2.2免疫方案 A組(常規耳緣靜脈注射組) 首次劑量為每只家兔1 ml 20% SRBC懸液，第2～5次采用10% SRBC，每次間隔6 d，末次注射后第7天取免疫兔血，分離血清檢測效價。B組首次劑量1 ml 20% SRBC懸液和1 ml完全弗氏佐劑混合，制備成“油包水”乳狀液，2 ml/只家兔，腋下多點注射，第2～5次免疫用10% SRBC和不完全弗氏佐劑體積按1∶1混合制備成“油包水”乳狀液，2 ml/(只·次)，注射次數和間隔時間同A組(見表1)。

1.2.3免疫血清效價的檢測 于末次免疫后一周進行兔頸動脈無菌取血，4℃冰箱過夜，次日收集血清，分裝，置于-80℃冰箱保存。采用補體溶血實驗和間接ELISA方法分別檢測兩種不同免疫方案所制備的免疫血清效價。

1.2.4溶血實驗 溶血素稀釋度及各種試劑的量，見表2。

1.2.5間接ELISA測定免疫血清效價 用包被緩沖液將抗原(10% SRBC懸液反復凍融5次)1∶100稀釋，100 μl/孔加入ELISA板，加封口膜后置4℃過夜。用PBST緩沖液洗板3次后，每孔加入1% BSA封閉液200 μl，37℃孵育。PBST洗滌3次，依次加入倍比稀釋的免疫兔血清(1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000和1∶512 000)，100 μl/孔，置于 37℃孵育1 h，PBST洗滌5次，甩干后，加入1∶1 000 稀釋HRP標記的羊抗兔 IgG 100 μl(同上孵育及洗滌)，加入TMB底物顯色液，100 μl/孔，37℃避光反應20 min后，450 nm處讀取結果。同時設空白對照和陰性對照孔。

表1 A 組、B 組制備家兔SRBC溶血素的免疫方案

表2 溶血素效價的測定

2 結果

2.1兩種免疫方法溶血素效價的比較 A組家兔溶血素效均價為1∶800；B組溶血素效價均為1∶3 200。B組溶血素比A組效價高4倍(見表3)。

2.2兩種免疫血清間接ELISA效價的比較 經間接ELISA檢測免疫家兔的效價，A組效價均為1∶64 000，B組效價均為1∶256 000。見表4。

表3 兩組溶血素效價的測定結果

表4 兩組溶血素ELISA的測定結果

3 討論

補體參與的溶血實驗是以綿羊紅細胞為抗原，在體外與相應的IgG和/或IgM抗體(溶血素)結合形成抗原抗體復合物，通過經典途徑激活補體，在紅細胞膜上形成攻膜復合物(MAC)，引起紅細胞的溶破，發生溶血反應。由于該實驗可驗證補體細胞毒的生物學功能，并與臨床上常見的輸血反應、新生兒溶血癥和自身免疫性溶血性貧血密切相關，成為醫學免疫學中經典的實驗之一。采用SRBC懸液作為抗原，經耳緣靜脈免疫家兔制備溶血素是經典的制備溶血素方法[3]。本實驗室單抗平臺研究組在制備抗腫瘤相關抗原抗體的免疫過程中，設計了完整細胞加佐劑免疫組，其獲得陽性克隆的比例明顯高于單純細胞免疫組。受此啟發，本研究以常規耳緣靜脈免疫途徑制備溶血素方法為對照，采用SRBC懸液加佐劑免疫方法制備溶血素，通過比較溶血實驗和間接ELISA兩種方法，得出結果，加佐劑免疫方法比常規方法制備溶血素效價高4倍，值得推廣。溶血素效價的判斷可能和實驗系統有關。李洱花等[1]和張淑莉等[4]溶血試驗中采用0.1 ml 1% SRBC抗原檢測溶血素效價達到1∶4 800和1∶3 000。為了方便學生觀察實驗結果，本溶血實驗采用0.2 ml 2% SRBC作為抗原，抗原量比有些院校的溶血實驗高4倍，這可能是SRBC懸液經耳緣靜脈免疫家兔制備溶血素造成效價差別的原因。