蛋白芯片法多腫瘤標志物檢測在健康體檢人群中腫瘤篩查的意義①

姜艷梅 王 晶 吳金明 張洪斌 林愛蓮 王 楠

(大連醫科大學附屬第一醫院檢驗科，大連 116011)

惡性腫瘤是一類嚴重威脅人類身體健康的常見病，早期發現、及時診斷是該病治療及判斷預后的關鍵，也是降低死亡率的最有效方法。腫瘤標志物(tumor marker，TM)是指在惡性腫瘤的發生和增殖過程中，由腫瘤細胞合成分泌的或由機體對腫瘤反應而異常產生的/或升高的，反映腫瘤存在和生長的一類物質，對腫瘤的輔助診斷、鑒別診斷、療效觀察、監測復發及預后評價具有一定價值。目前TM除前列腺特異性抗原(prostate specific antigen,PSA)有相對較好的特異性外，其他均無嚴格的組織器官特異性，部分TM因受多因素影響在健康人群中也會異常表達，在惡性腫瘤的診斷和鑒別中受到一定限制。因此，建議多種TM聯合檢測，以達到提高惡性腫瘤診斷率的目的[1]。

蛋白芯片技術的發展為多TM聯合檢測提供了理想的工具，TM蛋白芯片分析技術是一門由生命科學和微電子學科相交叉的技術，通過該技術可以高靈敏、高通量及高特異性地進行蛋白質的微量分析[2]。本文將對比蛋白芯片多TM檢測系統與電化學發光方法檢測TM的結果，同時分析我院健康體檢人群篩查結果，并對陽性個體追蹤隨訪，探討健康體檢人群中蛋白芯片法多腫瘤標志物篩查對惡性腫瘤早期診斷的臨床意義。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 2017年6月～2018年5月大連醫科大學附屬第一醫院體檢中心健康體檢者7 339例，其中分別進行C6和C12A檢測的體檢者為5 944例和1 395例，年齡25～86歲，平均年齡為45.5歲。

1.1.2試劑和儀器 HD-2001A/LU-07型系列生物芯片檢測儀和多腫瘤標志物蛋白芯片檢測C6和C12A試劑盒購自上海銘源數康生物科技有限公司,C6的檢測項目為癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、糖鏈抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)、糖類抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)、細胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment，CK19)和鱗癌抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCC)，C12A在C6的基礎上又添加了神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、β人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin β subunit，β-HCG)、結合型前列腺特異性抗原(combined-Prostate specific antigen，c-PSA)、糖類抗原15-3(carbohydrate antigen 15-3，CA15-3)、CA72-4和CA242；本實驗通過本院倫理委員會批準，CobasE601電化學發光免疫分析儀及其配套試劑盒購自羅氏；i2000化學發光免疫分析儀及其配套試劑盒購自雅培公司(用于檢測SCC)。

1.2方法

1.2.1比對實驗 根據芯片檢測范圍，選取18例患者血清標本及2個水平羅氏質控血清分別應用多腫瘤標志物蛋白芯片檢測儀及羅氏電化學發光分析儀進行檢測，具體操作步驟參照儀器及試劑說明書，將所得結果進行比對分析。

1.2.2標本檢測 空腹采集外周血3.5 ml離心分離血清，4℃冰箱保存且在4 d內檢測完畢。對于檢測結果異常者采用CobasE601電化學發光免疫分析儀(SCC采用雅培i2000化學發光免疫分析儀)進行單個項目TM檢測復查，并與芯片法結果進行比對分析。對高度疑似病例隨訪調查，通過病理學和影像學等進一步檢查以明確診斷。

1.2.3結果判斷 兩種方法檢測12項腫瘤標志物正常參考區間，見表1。TM指標檢測超過正常參考區間即診斷為陽性。以電化學發光法為標準，對蛋白芯片法進行方法學評價(真/假陽性、真/假陰性的判斷)。對于經蛋白芯片法檢測升高的標本，經電化學發光法復查后據此出具結果。

1.3統計學方法 采用GraphPad Prism 5軟件進行統計學分析，定性變量統計描述采用百分比和頻數，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1芯片法與電化學發光法結果比對分析 根據CANS-CL02-A003文件，使用不同參考區間的檢測系統間不宜進行結果比對。CEA、CA19-9、CA125、CK19、CA72-4、CA15-3采用定量結果比對分析，而AFP、NSE、 β-HCG則根據各自的參考區間判斷是否為陽性，按定性結果比對分析。定量比對分析的結果如圖1所示，兩種檢測方法相關性較好(P<0.001)，總體K值大于1，CEA線性最好，r2>0.95，CA125和CA15-3，r2<0.90，其余三項r2在0.90～0.95之間，具有很好的線性。定性比對分析的三個項目，采用配對資料的卡方檢驗，兩種方法無顯著性差異(P>0.05)，且不符合以化學發光法為準：AFP假陰性1例、假陽性1例，NSE假陽性1例，β-HCG 2例均為假陰性。

表1 蛋白芯片法和化學發光法檢測TM的參考區間

圖1 蛋白芯片法與電化學發光法方法學比較分析結果Fig.1 Comparative analysis of tumor markers detecded by protein chip and chemiluminescence

2.2蛋白芯片法檢測健康體檢人群TM結果 自2017年6月1日～2018年5月31日，共有7 339例健康體檢者利用蛋白芯片法檢測了多項TM，TM檢出結果異常的標本601例，共637個項目，其中單項指標異常571例，組合指標(以兩項指標同時異常為主)異常30例，有6例體檢者以上3項均異常，總陽性率為8.18%，其中男性檢出率為8.62%(383/4 442)，女性檢出率為7.52%(218/2 897)。本團隊對結果異常的體檢者進行了6～18個月的跟蹤隨訪，601例陽性標本中有13例經臨床診斷為腫瘤病人，腫瘤檢出率為0.2%，2例在體檢前已經接受過腫瘤相關治療；有81例存在良性甲狀腺結節、肺結節、膽囊炎、膽囊結石、男性有前列腺增生或肥大等；169例由于生理變化及不良生活習慣引發TM升高，有28例3到12個月后異常項目恢復正常；其余均為不明原因TM異常，該組病人有待于繼續追蹤隨訪研究。

表2 健康體檢者蛋白芯片法腫瘤標志物檢測結果

表3 蛋白芯片法檢出腫瘤標志物異常結果與應用化學發光法復檢結果比較

表4 嗜異性抗體血清異常結果復查前后對比

601例健康體檢標本中，各個檢測項目的異常例數和檢出率如表2所示，CA72-4、CEA、CA242的檢出率較高，依次為7.12%、2.49%、2.44%；β-HCG、CA15-3、AFP檢出率較低，依次為0.43%、0.36%、0.11%。除與性別有關的TM外，男女人群中，CEA、CA125、CA242檢出率差別較大。

2.3蛋白芯片法檢測異常結果與化學發光法結果比較分析 蛋白芯片法檢測超出正常參考值范圍的項目選用電化學發光法進行單個項目TM復查(SCC使用化學發光法進行復檢)，根據年齡、升高程度以及是否為多項目異常等指標，共復查196 例，不包括污染和嗜異性抗體15例。在復查的196例標本中，兩種方法結果一致，即真陽性者為151例(77.04%)，有47個項目的45例標本芯片法與化學發光法檢測結果存在顯著性差異，其中39例標本進行了SCC復查，只有9例結果一致，除去SCC后，真陽性率為90.44%。蛋白芯片法檢出異常結果與化學發光法檢測具體結果見表3。蛋白芯片法讀取結果時根據是否顯色均勻明亮判斷患者是否存在嗜異性抗體，將懷疑標本應用化學發光法復檢，結果如表4。

3 討論

近年來，腫瘤的發生率逐年升高，在腫瘤發生發展過程中，早期癥狀隱匿，多數患者就診時已發展為晚期，因此早期診斷對腫瘤的治療和預后有十分重要的意義。目前，TM檢測已成為繼影像學和病理學診斷之后臨床最常用的腫瘤診斷方法，在腫瘤普查、早期診斷、判斷預后和轉歸以及評價療效等方面具有較高的應用價值。與酶聯免疫分析、放射免疫分析等傳統的TM檢測方法相比，蛋白芯片法以微陣列原理為基礎，與化學發光免疫膜技術結合，應用計算機圖像分析方法聯合檢測血清中的TM，具有樣本用量少[3，4]、檢測通量大等優點。隨著人們對腫瘤的了解越來越多，高危人群對自己健康的關注日益增加，這種方便、多項目聯合的檢測方式越來越受到體檢人群尤其是高危人群的歡迎。

蛋白芯片法檢測TM利用抗原抗體特異性結合原理，采用雙抗體夾心法，固相基質上包被的TM特異性單克隆抗體，捕獲被檢血清中對應的TM，然后結合第2代抗體(攜帶示蹤標記物)，通過特定的化學反應產生光信號，用配套的生物芯片閱讀儀讀取光信號，以已知TM濃度做標準，對未知血清進行定量檢測[5]。盡管蛋白芯片檢測有諸多優點，但蛋白芯片法的應用也存在一些爭議，有研究者表示其與單個血清TM檢測比較存在一定的假陽性[6]。本研究收集了2017年6月～2018年5月期間到大連醫科大學附屬第一醫院體檢患者的數據進行分析。

本研究首先對蛋白芯片法和電化學發光法檢測TM進行了方法學的比較分析，六項定量分析項目結果顯示兩種方法間有明顯的相關性，r2分布在0.77～0.96之間，其中CA15-3因為高值偏離，造成r2值較低，其余都呈良好的線性，兩種方法沒有顯著性差異；由于AFP、NSE、β-HCG芯片法與電化學發光法采用的參考區間不同，故采用定性的方法進行比較分析，結果顯示兩種方法無顯著性差異，僅有個別標本存在差異，以電化學發光法為標準判斷，AFP有1例假陽性，1例假陰性，AFP有1例假陰性，1例假陽性，β-HCG 2例則均為假陰性，與比對結果相同，在后續的工作中也遇到了AFP假陰性結果，因此在應用芯片法做健康人群腫瘤篩查時需注意結合臨床，必要時應采取其他方法復檢。

本研究根據患者的需求分別采用了6項或12項蛋白芯片分析了7 339例健康體檢者血清中多項TM，結果顯示7 339例樣本應用蛋白芯片法檢測共601例標本結果異常，總檢出率為8.18%，男性高于女性，CA72-4檢出率最高，AFP檢出率最低，CEA和CA242在男性和女性群體中檢出率存在較大差別，可能與男性吸煙、喝酒等不良生活習慣有關。本研究中總檢出率高于國內的其他同類研究[6-8]，這些研究的檢出率在2.2%-3.8%之間，但也有報道檢出率和本文相近[9]。原因可能是由于在芯片C12A中包括CA72-4和SCC，而這兩個項目檢出率較高，其中有39例標本進行了SCC復查，只有9例結果一致，假陽性率較高，可能與操作過程中污染有關。SCC在人的唾液和皮膚中含量很高，而芯片法所需操作步驟較多，容易被污染，根據這個數據，擴大復查率的同時也要求檢驗人員在生物安全柜內操作，避免污染。

對于研究過程中的異常結果，本研究組應用了臨床認可的方法進行了復查[6-7,10]。在檢測體檢者標本時，對蛋白芯片法檢測結果異常的標本結合體檢者其它情況，應用化學發光法對196例標本進行復查，除去SCC以外有9例為假陽性，與方法學比較結果相近，真陽性率為90.44%，假陽性的分別為CEA 6例、CA125 3例、CA19-9 5例，AFP、NSE、CA72-4分別1例，可能由于不同抗體反應需要的時間不同，而蛋白芯片法將多種抗體置于同一基質片上采用相同的反應時間，會影響檢測的結果[10]。這一研究結果與其他國內研究結果基本一致，龔倩等[6]應用雅培I2000化學發光免疫分析儀對190例陽性標本進行復查，只有9例不符合前期結果，包括2例CA19-9、1例PSA、2例CEA、1例β-HCG；韓偉平等[7]應用CobasE411電化學發光免疫分析儀復查結果陽性233例，真陽性率95%。與其他國內研究相比，本研究的12項蛋白芯片采用的是C12A，將兩項PSA整合為c-PSA，HCG變為β-HCG，增加了SCC，敏感性也有所提高。另外在實驗過程中，有15例標本因顯色異常判斷為含有嗜異性抗體(人抗鼠抗體)，從而導致單項或多項結果異常[11]。應用蛋白芯片法測定TM時，檢測試劑中與TM反應的是2種不同的鼠單克隆抗體，如果病人血清中存在嗜異性抗體，它可在2種抗體間起“橋梁”作用，導致在無抗原的情況下，抗體與抗體直接結合而呈陽性反應，進而造成TM濃度增高的假象。

另外，對復檢后兩種方法檢測結果相符合的體檢者進行跟蹤隨訪，利用病理學、影像學等檢測手段對于高度疑似病例做進一步確診，其中有2例體檢時已確診癌癥，13例體檢后不同時間經臨床確診罹患腫瘤，腫瘤檢出率為0.2%，其中有11例為多TM異常，因此多項TM聯合檢測對于健康體檢人群惡性腫瘤篩查相對單項篩查更有意義[12-13]；有部分健康體檢者是由于良性疾病引起的TM異常，以甲狀腺結節居多，這與該疾病在大連地區多發有關；也有部分體檢者幾個月后復查恢復正常。半數體檢者為TM不明原因的升高，該部分患者值得我們長時間的跟蹤。

綜上所述，蛋白芯片法檢測多TM具有創傷小、成本低、靈敏度高等特點，一次最多可同時檢測12種常見的TM，操作方法簡單，提高了檢測效率。與其他方法相比，這種聯合檢測系統更適宜于健康體和無癥狀人群篩查，尤其對高危人群的腫瘤普查具有很高的早期診斷價值。經過對7339名健康體檢者的篩查，至文章撰寫結束時，隨訪半年到一年時間，有13例新發病例，這些病例的診斷與TM的異常是分不開的。但同時也要注意，一些良性疾病、吸煙、飲酒、嗜異性抗體等均可影響檢測結果[14]。鑒于有部分結果異常的體檢者，經過復查后正常或異常原因不明，應用蛋白芯片法對于健康體檢人群進行多TM檢測時，更換結果異常者復檢方法的同時，需聯合CT、B 超、病理檢查等手段進行綜合判斷，并且要定期復查、隨訪等，從而更好的達到早期發現、早期治療的目的。