急性T淋巴細胞白血病IL-7R突變的研究

張 慧，朱紅勝，劉文亞

(南京醫科大學附屬蘇州醫院 蘇州市立醫院 檢驗科，江蘇 蘇州 215002)

急性T淋巴細胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)是胸腺細胞多個基因異常的惡性侵襲性腫瘤， 兒童和成人新診斷為T-ALL病例分別占15%和25%。在T-ALL中目前比較明確的突變基因主要是IL-7R、WT1、FBXW7、NOTCH11和PHF6[1-5]。IL-7在T淋巴細胞的正常發育和功能維持中有著非常重要的作用，主要通過與IL-7R結合發揮其生物學功能[6]。除了IL-7，其他的細胞因子胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)也可結合IL-7R而組成TSLP受體的另一條鏈TSLPR。IL-7R和CRLF2信號在早期T淋巴細胞發育成熟過程中有著非常重要的作用[7]；IL-7通過啟動JAK/STAT5和PI3K/AKT/mTOR信號途徑活化促進T細胞的生存和細胞周期進展[8]。有研究發現在T-ALL患者中可以檢測到IL-7R的突變[6]，為進一步研究T-ALL患者中IL-7R的突變情況，本研究對125例ALL患者進行第二代測序，探討ALL中IL-7R 突變特征。

1 資料與方法

1.1病例選擇 收集2008年6月至2018年10月蘇大附一院和蘇州市立醫院共125例T-ALL骨髓標本庫患者，提取其基因組DNA，研究對象均經遺傳學、細胞形態學、免疫表型、和分子生物學確診，其中男102例，女23例；男：女比4.43:1，年齡范圍7～32歲，中位年齡23歲。125例患者中，49例患者未在我院行誘導化療，治療情況不詳。其余分別給予VDCP(長春新堿類+蒽環類+環磷酰胺+糖皮質激素+酪氨酸激酶抑制劑)和VDCLP方案(長春新堿類+蒽環類+環磷酰胺+門冬酰胺酶+糖皮質激素)。

1.2儀器與試劑 DNA提取試劑盒、測序反應通用試劑盒、水平離心機(LDZ-5)、光學顯微鏡(日本Olympus公司)、PCR儀(ABI2720)(美國ABI公司)、PCR擴增引物。

1.3方法 按照DNA提取試劑盒說明書進行。按照儀器和試劑盒說明書對IL-7R基因進行PCR擴增；擴增產物送公司測序，基因突變陽性樣本進一步進行TA克隆。

1.4統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統計學處理。計數資料以百分比或率表示，采用χ2檢驗(或Fisher精確概率檢驗)；非正態分布計量資料以中位數(四份位數)表示，采用非參數Mann-Whitney檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1實驗室指標和預后 兩組WBC、Hb、Plt、LDH 、原始細胞、復發率及病死率等指標在兩組之間差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 兩組實驗室指標和預后比較

2.2125例T-ALL脾臟、肝臟和淋巴結浸潤的比例 在125例T-ALL患者中有脾臟浸潤者57.6%(72/125)，有肝臟浸潤者29.6%(37/125)，有淋巴結浸潤者56.0%(7/125)。

2.3IL-7R突變信息 IL-7R突變位于IL-7R跨膜區的P240-S246序列；突變的類型為開放閱讀框的插入和缺失，7例突變類型分別為：c.727-730 InsAGCCACTGCCAGG DelCTAA, c.724-736 InsCCTACGGGAT DelTTACTAACCATCA, c.732 InsGGGCCCAATATTGTGACGT DelC， c.724-736InsCCTACGGGAT DelTTACTAACCATCA，c.732 InsCTAAGGTGC，c.731-732 InsGGTTGTCAGAG DelAC， c.720-736 InsAAAACGGT DelTATCTTACTAACCATCA。見表2和圖1。

表2 T-ALL中IL-7R突變插入缺失的具體堿基序列及其他基因突變情況

3 討 論

IL-7R在T淋巴細胞的發育、成熟、細胞內環境穩定的維持等方面有著重要的作用[9]。本研究125例T-ALL患者中IL-7R基因突變率為5.6%(7/125)，Shochat等[7]研究中IL-7R在ALL中的突變率為10.5%，Zenatti等[10]報道IL-7R基因突變率為9%，本研究IL-7R基因突變率稍低于后兩者的報道。本研究中7例IL-7R基因突變者同時伴有Notch1基因突變的有2例，伴有PFH6突變的有1例，伴有WT1突變的有1例。7例IL-7R基因突變的類型是開放閱讀框的插入和缺失，突變的位置位于IL-7R跨膜區的P240-S246序列，與文獻報道基本一致[10]。

圖1 IL-7R突變插入缺失的具體堿基序列圖 方框內為插入的序列(所有插入-缺失突變均為雜合，只有等位基因分離后才顯示突變的等位基因)。WT：野生型；Ins：插入；Del：刪除

本組IL-7R突變分別是c.727-730 InsAGCCACTGCCAGG DelCTAA, c.724-736 InsCCTACGGGAT DelTTACTAACCATCA, c.732 InsGGGCCCAATATTGTGACGT DelC， c.724-736InsCCTACGGGAT DelTTACTAACCATCA，c.732 InsCTAAGGTGC，c.731-732 InsGGTTGTCAGAG DelAC， c.720-736 InsAAAACGGT DelTATCTTACTAACCATCA。本研究顯示，兩組病死率差異無統計學意義。由于突變患者比較少，需擴大樣本量進一步研究該基因突變對預后的影響。研究顯示，IL-7R突變產生一個半胱氨酸，使相鄰的鏈產生同源二聚化，導致二硫鍵的形成，使受體發生構像改變，導致信號通路持續活化而參與腫瘤形成機制[11]。另外，有研究報道IL-7R的5號外顯子也可以發生基因突變[12]。這就要求我們擴大T-ALL患者的樣本量、增加T-ALL病人的信息作進一步的研究。

生物學和功能分析表明這些突變的IL-7R基因可激活造血祖淋巴細胞獨立生長的細胞因子[7]。有研究指出IL-7R和CRLF2的突變表明額外增加在近膜處的半胱氨酸是白血病Ⅰ型細胞因子受體基因突變激活的機制[7]。針對T-ALL的靶向治療方案仍缺乏特異性以及不良反應大等問題，這些問題有待于進行更深入性的探究和解決。強化化療方案的應用使兒童T-ALL患者預后顯著提高，但成人及復發耐藥T-ALL患者的預后仍較差。研制新型靶向藥物特異性阻斷T-ALL細胞內生存及耐藥相關的異常激活信號通路近年來被認為是治療成人及復發難治T-ALL患者的新策略[13-16]。近年來，雖然對IL-7R突變在T-ALL中具體機制仍不清楚，但對IL-7R基因在T-ALL中的認識不斷增加。綜上所述，本研究發現的若干突變位點和類型值得進行深入的功能和機制研究，需進一步擴大樣本量進一步研究該基因突變在T-ALL患者中的影響。