響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助法提取拐棗種子中二氫楊梅素的工藝

張曉南 朱鴻維 趙善舶 白 晨 石雅楠徐浩朋 尹 戀 胡淑敏 尹 花*

(1.青島啤酒股份有限公司，啤酒生物發(fā)酵工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266071； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150036)

拐棗(HoveniadulcisThunb.)為鼠李科(Rhamnaceae)枳椇屬(Hovenia)高大喬木，主要分布于我國(guó)華北、西、華東、西南等地區(qū)[1]。嫩枝、幼葉背面、葉柄和花序軸初有短柔毛，后脫落。葉片橢圓狀卵形、寬卵形或心狀卵形；果柄含多量葡萄糖和蘋果酸鉀，經(jīng)霜后甜，俗稱“拐角”[2]，拐棗的成熟種子(又稱枳椇子)[3]呈暗褐色或黑紫色，近扁球形，有光澤，民間常用來(lái)泡水喝，可以快速緩解和治療身體的某些不適感覺[4～5]。

過量飲酒會(huì)導(dǎo)致乙醇中毒而引發(fā)肝臟受到損傷[6～8]，乙醇進(jìn)入人體后，大部分在肝臟中代謝，只有少量的乙醇通過胃腸道排出。大量滯留的乙醇代謝最終會(huì)造成人體的乙醛中毒現(xiàn)象，長(zhǎng)期飲酒會(huì)導(dǎo)致酒精性肝病、肝硬化疾病的生成[9～10]。拐棗種子的臨床應(yīng)用主要針對(duì)大量飲酒后的癥狀如：頭暈，乏力，煩渴，嘔吐等現(xiàn)象[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道：拐棗種子中的二氫楊梅素(Dihydromyricetin)(見圖1)是較為特殊的黃酮類化合物[12～13]，它具有解除醇中毒、預(yù)防酒精肝、抑制肝細(xì)胞惡化、降低血脂和血糖水平的作用；同時(shí)經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)表明，二氫楊梅素對(duì)枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌、大腸埃希菌、產(chǎn)氣桿菌、啤酒酵母、黏紅酵母、青霉、黑曲霉、黃曲霉、毛霉及根霉均有抑菌作用[14～16]。

圖1 二氫楊梅素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structure of dihydromyricetin

超聲輔助提取是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型提取技術(shù)，超聲波所獨(dú)具的物理特性能促使植物細(xì)胞組織破壁或變形，使有效成分提取更充分，提取速度快，能耗較低[17～18]。超聲輔助技術(shù)對(duì)拐棗種子二氫楊梅素的提取研究也未見報(bào)道。因此本文為首次創(chuàng)新，采用超聲法以二氫楊梅素得率為響應(yīng)因子對(duì)拐棗種子中的二氫楊梅素進(jìn)行提取，并采用響應(yīng)面優(yōu)化單因素提取結(jié)果，為規(guī)模化生產(chǎn)提供了重要的理論價(jià)值和研究意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器

拐棗種子采購(gòu)于哈爾濱三棵樹中藥材市場(chǎng)，經(jīng)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院江連洲教授鑒定后備用。原料預(yù)處理、清除機(jī)械雜質(zhì)(砂子草棍等)后，粉碎至250～850 μm范圍內(nèi)，含水率為10.3%，備用。色譜純甲醇購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；對(duì)照品二氫楊梅素購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。超純水采用(RX-UPT,上海和泰儀器有限公司)流動(dòng)水凈化儀制得。

KJ-1340AL型臺(tái)式超聲波提取裝置(廣東深圳柯潔有限公司)，超聲浴槽尺寸360 mm×180 mm×235 mm；3K30型離心機(jī)(SIGMA公司)；美國(guó)Waters e 2695-2489高效液相色譜儀，Supelco Discovery C18色譜柱(尺寸：250 mm×4.6 mm,5 μm)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料脫脂處理

取處理后的拐棗種子粉末100 g置于2 L三角瓶中，加入1 000 mL石油醚(沸程60～90℃)，180 W超聲脫脂，超聲時(shí)間1 h，濾出石油醚，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收石油醚，再將回收的石油醚(適當(dāng)補(bǔ)加新石油醚)1 000 mL再于180 W功率超聲脫脂1 h，如此重復(fù)3次。得到的脫脂原料置于平盤通風(fēng)櫥中自然放置過夜，徹底揮干石油醚，置于夾鏈袋中保存，作為進(jìn)一步提取的實(shí)驗(yàn)材料，回收的石油醚留做下次使用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)條件1.2.2.1 高效液相色譜定量測(cè)定條件

采用高效液相色譜法定量測(cè)定二氫楊梅素。流動(dòng)相為甲醇-0.02 moL·L-1硫酸二氫鉀，洗脫流速為1.0 mL·min-1，柱溫25℃，進(jìn)樣體積10 μL。二氫楊梅素檢測(cè)波長(zhǎng)為290 nm,運(yùn)行時(shí)間為20 min。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密稱取對(duì)照品二氫楊梅素2.5 mg置于25 mL容量瓶中，流動(dòng)相溶解并定容，得每毫升含二氫楊梅素0.1 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液備用。分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1、2、4和6 mL，置于10 mL容量瓶中，流動(dòng)相定容，配成不同濃度的對(duì)照品溶液。依次取10 μL上述對(duì)照品溶液進(jìn)樣，每個(gè)濃度重復(fù)3次。按上述色譜條件測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。二氫楊梅素在0.005～0.1 mg·mL-1之間呈良好的線性關(guān)系。其線性回歸方程為y=2 278 019x-610 490，R2=0.999 9。

1.2.2.3 樣品中二氫楊梅素的含量測(cè)定

提取液稀釋至適宜的檢測(cè)濃度后，過0.45 μm微孔濾膜，取濾出液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，每樣重復(fù)進(jìn)樣3次，將峰面積取平均值，代入回歸方程，依式1計(jì)算二氫楊梅素的得率。

Y%=c×V/M

(1)

式中：Y為二氫楊梅素得率%；c為二氫楊梅素的濃度(mg·mL-1)；V為提取液體積(mL)；M為原料重量(g)。

1.2.3 影響提取效果的因素試驗(yàn)1.2.3.1 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.5 g(絕干計(jì))拐棗種子脫脂干燥粉末原料，置于100 mL錐形瓶中，于超聲波提取器中在多種條件下提取，以確定提取因素變化范圍以及各因素的適宜值。將每次提取液過0.45 μm微孔濾膜，通過公式計(jì)算二氫楊梅素得率。

1.2.3.2 工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取A料液比，B超聲輻照功率，C超聲輻照時(shí)間共3個(gè)影響因子進(jìn)行響應(yīng)面分析，考慮到實(shí)驗(yàn)因素對(duì)得率的影響是曲線關(guān)系，故采用響應(yīng)面法尋找最佳工藝條件。根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以單因素試驗(yàn)中最佳水平作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的0水平，設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，取得試驗(yàn)結(jié)果后，采用3因子3水平的響應(yīng)面分析法，得到二次回歸方程，并找出最佳工藝參數(shù)(見表1)。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素編碼水平

Table 1 Levels of Plackett-Burman design extraction variables

代碼Code因素Factors水平Level-10+1A液料比Liquid-solid ratio(mL·g-1)152025B超聲輻照功率Ultrasound irradiation power(W)108144180C超聲輻照時(shí)間Ultrasound irradiation time(min)203040

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

因拐棗種子中二氫楊梅素易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑中，乙醇是毒性最低的有機(jī)溶劑，且對(duì)植物細(xì)胞壁有較強(qiáng)的穿透能力，對(duì)許多成分溶解性能好，所以本研究采用乙醇溶液為提取溶劑。不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇極性不同，對(duì)極性不同的物質(zhì)具有不同的得率。在保持其他條件不變(超聲輻照時(shí)間30 min，提取溫度40℃，超聲輻照功率為180 W，液料比20 mL·g-1)，改變提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)，拐棗種子中二氫楊梅素的提取得率如圖2。由圖2可以看出，二氫楊梅素的得率受乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響較大[19]。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，二氫楊梅素得率逐漸增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，二氫楊梅素得率達(dá)到最高。但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，二氫楊梅素的得率反而略有降低。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%作為從拐棗種子中提取二氫楊梅素的溶劑。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on yield of dihydromyricetin

2.1.2 液料比對(duì)提取效果的影響

實(shí)驗(yàn)中選擇合適的液料比可減少溶劑的浪費(fèi)，也會(huì)使提取過程工序簡(jiǎn)化，同時(shí)也減少溶劑回收帶來(lái)的麻煩。在保持其他條件不變(乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度40℃、超聲輻照功率180 W和超聲輻照時(shí)間30 min)，改變液料比，拐棗種子中二氫楊梅素的得率見圖3。由圖3可以看出，得率隨液料比的增大而升高，超過20 mL·g-1后升高緩慢。確定提取的液料比范圍是15～25 mL·g-1。

圖3 液料比的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on yield of dihydromyricetin

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 Effect of temperature on yield of dihydromyricetin

圖5 超聲輻照功率的影響Fig.5 Effect of ultrasound irradiation power on yield of dihydromyricetin

圖6 超聲輻照時(shí)間的影響Fig.6 Effect of ultrasound irradiation time on yield of dihydromyricetin

2.1.3 超聲溫度對(duì)提取率的影響

超聲提取溫度對(duì)提取會(huì)有影響，在保持其他條件不變(乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比20 mL·g-1、超聲輻照功率180 W和超聲輻照時(shí)間30 min)，采用不同溫度(30、40、50和60℃)對(duì)拐棗中二氫楊梅素進(jìn)行提取，結(jié)果如圖4所示：在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的溫度范圍(30～60℃)內(nèi)，二氫楊梅素的提取得率相差不大。比較而言，40℃的溫度可以滿足要求。

2.1.4 超聲輻照功率對(duì)提取效果的影響

圖5為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，提取溫度40℃，液料比20 mL·g-1，超聲時(shí)間30 min的提取結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)過程中，我們把超聲輻照功率分別設(shè)置成72、108、144和180 W 4個(gè)輻照功率梯度。由圖5可知：隨著超聲輻照功率的增加，二氫楊梅素的得率逐漸增加，功率在180 W有最大得率。這是因?yàn)閷?duì)于固定頻率的超聲波來(lái)說(shuō)，功率增大，聲強(qiáng)隨著增大。單位時(shí)間內(nèi)超聲產(chǎn)生的空化事件增多，從而有利于得率的提高。但是不能無(wú)限制的增大超聲功率，功率過大，導(dǎo)致能耗過高，操作噪音增強(qiáng)。為了進(jìn)一步明確超聲輻照功率對(duì)二氫楊梅素得率的影響，選取超聲輻照功率在108～180 W進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。

2.1.5 超聲輻照時(shí)間對(duì)提取效果的影響

提取時(shí)間決定著生產(chǎn)周期的長(zhǎng)短，決定著生產(chǎn)成本和能源的消耗，是生產(chǎn)工藝研究中一個(gè)十分重要的影響因素。當(dāng)溶劑為60%濃度的乙醇、提取溫度40℃、超聲輻照功率180 W、液料比為20 mL·g-1的情況下，不同超聲輻照時(shí)間對(duì)二氫楊梅素得率的影響見圖6。可以看出隨著超聲輻照時(shí)間的增加，二氫楊梅素得率逐漸增加，超過30 min后二氫楊梅素得率增加的趨勢(shì)有所降低。因此超聲輻照時(shí)間在20～40 min作為進(jìn)一步考察范圍。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken響應(yīng)面分析法進(jìn)行設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)具體設(shè)置顯示在表2中，17個(gè)實(shí)驗(yàn)中序號(hào)13～17為5個(gè)中心實(shí)驗(yàn)，用以分析實(shí)驗(yàn)誤差；其余12個(gè)為析因?qū)嶒?yàn)。以二氫楊梅素得率(Y)為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合各影響因子與響應(yīng)值的回歸方程為：

Y=-3.50+1.37A+1.93×10-1B+6.33×10-1C-1.93×10-3AB-7.37×10-3AC-1.04×10-3BC-2.15×10-2A2-4.33×10-4B2-5.63×10-3C2

(1)

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 2 Box-Behnken experimental design and results

序號(hào)No.A:液料比Liquid-solid ratio(mL·g-1)B:超聲輻照功率Ultrasound irradiation power(W)C:超聲輻照時(shí)間Ultrasound irradiation time(min)二氫楊梅素得率Yield of dihydromyricetin(mg·g-1)120108200.64220108401.37320180201.42420180400.66515144200.66615144401.36725144201.47825144400.69915108300.701015180301.211125108301.581225180300.701320144302.091420144302.181520144302.111620144302.181720144302.17

通過表3的方差分析結(jié)果可以看到二氫楊梅素得率回歸方程各變量對(duì)指標(biāo)影響的顯著性。概率P值越小，表明相應(yīng)變量的顯著程度也越高。各因素中平方項(xiàng)A2、B2、C2，交互作用項(xiàng)AB、AC、BC對(duì)二氫楊梅素得率的影響均為極顯著(P<0.01)，A對(duì)二氫楊梅素得率的影響為顯著(P<0.05)，可見，所涉及的液料比、超聲輻照功率和時(shí)間因素對(duì)響應(yīng)值二氫楊梅素得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，各因素對(duì)二氫楊梅素得率影響主要是二次方效應(yīng)和交互效應(yīng)。表3中回歸方程的P值小于0.000 1表明可以利用該模型對(duì)拐棗中二氫楊梅素提取效果進(jìn)行分析。失擬項(xiàng)是用來(lái)評(píng)估方程可靠性的一個(gè)指標(biāo)，方程分析結(jié)果顯示失擬項(xiàng)F值為6.09，不顯著，說(shuō)明該回歸方程擬合的比較好，可以很好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，利用該方程確定拐棗中二氫楊梅素的最佳提取條件[20]。由二次回歸模型得到每2個(gè)因素同時(shí)對(duì)響應(yīng)值的影響結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，二氫楊梅素得率的響應(yīng)曲面均為開口向下的凸面，且凸面中心在考察區(qū)域之內(nèi)，表明在考察區(qū)域范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的最大值。通過Design-expert統(tǒng)計(jì)軟件分析，得出拐棗種子中二氫楊梅素超聲輔助提取的最佳條件為：液料比20.42 mL·g-1，超聲輻照功率142.13 W，超聲輻照時(shí)間29.78 min，二氫楊梅素理論得率為2.15 mg·g-1。

表3 二氫楊梅素得率回歸方程方差分析

Table 3 Variance analysis of regression equation for dihydromyricetin

方差來(lái)源Source平方和Sum of squares自由度Degree of freedom均方Mean squareF值F-valueP值Prob>F顯著性SignificantModel5.9690.66123.62<0.0001**A0.0310.036.020.0439*B0.0110.012.170.1843C0.0010.000.330.5853AB0.4810.4889.73<0.0001**AC0.5410.54101.37<0.0001**BC0.5610.56104.01<0.0001**A21.2211.22227.91<0.0001**B21.3211.32247.09<0.0001**C21.3311.33248.84<0.0001**殘差Residual0.0470.01失擬合Lack of fit0.0330.016.090.0567純誤差Pure error0.0140.00總離差Cor total6.0016

注：*P<0.05；**P<0.01

2.3 最佳工藝條件驗(yàn)證

據(jù)理論最佳條件，為方便操作，選取各條件臨近整數(shù)值，具體過程為：準(zhǔn)確稱取拐棗種子粉末0.5 g，按照液料比20.5 mL·g-1加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，超聲浴溫度40℃，超聲輻照功率140 W，超聲輻照提取30 min，提取液過濾，過0.45 μm微孔濾膜，HPLC測(cè)定并計(jì)算二氫楊梅素得率，重復(fù)試驗(yàn)5次，數(shù)據(jù)取平均值，結(jié)果二氫楊梅素得率為2.14±0.09 mg·g-1，與理論預(yù)測(cè)值非常接近，誤差小于5%，說(shuō)明該最佳工藝條件合理可行，在該工藝下，得率最佳。從而驗(yàn)證了模型的正確性。

圖7 各因素對(duì)二氫楊梅素得率的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Effects of different factors on the yield of dihydromyricetin

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲輔助提取法從拐棗種子中提取二氫楊梅素，通過單因素實(shí)驗(yàn)探討了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、超聲輻照功率和時(shí)間對(duì)提取工藝的影響進(jìn)行了考察，采用響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化，得到了滿意的提取率[21]。得到的最優(yōu)工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60%；提取溫度40℃；超聲輻照時(shí)間30 min；超聲輻照功率140 W，液料比20.5 mL·g-1。最佳工藝條件下拐棗種子中二氫楊梅素提取得率為2.14±0.09 mg·g-1，為實(shí)現(xiàn)拐棗資源高附加值的綜合加工利用奠定了基礎(chǔ)。