熱休克蛋白90α 甲胎蛋白和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3聯合檢測在原發性肝癌診斷中的應用

任玲君 余國慶 方麗娟

肝細胞肝癌（HCC）是目前臨床最高發的惡性腫瘤之一［1］。甲胎蛋白（AFP）是目前臨床使用最基礎的血清學標志物，因診斷敏感性僅40%～65%［2-4］，且早期肝癌陽性率更低，有些患者甚至整個病程中血清AFP一直呈陰性［5］。另外，部分其他腫瘤（如胃癌、結腸癌、肺癌等）也會出現不同程度的陽性率［6-8］。但單用AFP進行肝癌的早期診斷有明顯的缺陷，發掘新的血清標志物尤為重要［9］。熱休克蛋白90α（Hsp90α）是一組與細胞感受應激損傷關系密切的蛋白質［10］，具有分子伴侶作用，參與多種細胞內蛋白的折疊、裝配及運轉［11］，研究發現，Hsp90α與腫瘤發生、生物學行為及其預后有較密切關系，Hsp90α在肝癌中高表達，可作為肝癌早期診斷標志物［12］。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）是一類分布在細胞膜表面的蛋白聚糖，通過一系列細胞表面受體信號傳導來調節其形態和行為［13］，文獻報道早期肝癌組織中GPC3水平顯著升高，有較高的靈敏度和特異性，有望成為肝癌早期診斷或鑒別診斷有價值的新的血清學標志物［14］。Hsp90α和GPC3的臨床應用給肝癌的早期診斷提供可能，本資料中利用血清Hsp90α、AFP和GPC3進行聯合檢測，旨在通過研究發現其單一或聯合檢測對原發性肝癌的診斷效果及臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2015年4月至2017年3月患者及體檢者共619例，其中男317例，女302例；年齡15～90歲，平均（49.95±7.43）歲。其中HCC患者193例，男101例，女92例，平均年齡（51.15±6.62）歲；肝硬化患者127例，男63例，女64例，平均年齡（49.95±5.77）歲；慢性肝炎患者101例，男53例，女49例，平均年齡（50.55±7.43）歲。對照組198例為體檢健康者，其中男101例，女97例，平均年齡（52.02±6.48）歲。肝癌組、肝硬化組、慢性肝炎組和健康對照組的性別、年齡、體重量指數等臨床資料比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。本研究均與患者簽署知情同意書。

1.2 實驗室檢查 取各組受試者靜脈血3ml，靜置15～30min后以3500g離心5min，4h內完成血清Hsp90α、AFP及 GPC3檢 測。Hsp90α 和 GPC3試劑及校準品來自于江蘇酶免實業有限公司ELISA法，用sunrise型酶標儀測定；血清AFP檢測采用Abbott i2000分析儀及配套試劑，檢測過程嚴格按照SOP文件操作。1.3 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。采用多因素logistics回歸分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

表1 肝癌組、肝硬化組、慢性肝炎組和健康對照組臨床資料比較（）

表1 肝癌組、肝硬化組、慢性肝炎組和健康對照組臨床資料比較（）

組別 肝癌組 肝硬化組 慢性肝炎組 對照組 統計量 P值例數 193 127 101 198性別比（n，男/女） 101/92 63/64 52/49 101/97 χ2=0.215 0.928年齡（歲） 51.15±6.62 49.95±5.77 50.55±7.43 52.02±6.48 t=0.610 0.648體重量指數（kg/m2）19.62±1.52 19.52±1.13 18.99±1.41 19.85±1.23 t=0.664 0.625

2.1 各組血清Hsp90α、AFP及GPC3水平比較 見表2。

表2 各組Hsp90α、AFP和GPC3水平比較［g/L，（）］

表2 各組Hsp90α、AFP和GPC3水平比較［g/L，（）］

注 ：與 T0比較，*P＜0.05，#P＜0.05

組別HCC組肝硬化組 慢性肝炎組 對照組 P值T0期 T1期 T2期 T3期 T4期n 51 48 45 41 8 127 101 98 Hsp90α 0.054±0.012 0.065±0.014 0.074±0.008 0.085±0.006* 0.082±0.005# 0.014±0.002 0.004±0.003 0.002±0.001 ＜0.05 AFP 426.18±58.62 583.24±62.65 749.25±57.18 765.52±43.62* 752.62±35.39# 126.18±15.99 86.18±5.79 9.07±1.49 ＜0.05 GPC3 216.28±34.39 224.40±43.21 239.01±50.07 445.80±53.15* 644.20±47.33# 151.70±13.97 191.20±13.21 13.50±9.01 ＜0.05

圖1 Hsp90α在HCC未轉移及轉移患者中的表達差異

2.2 Hsp90α在HCC未轉移及轉移患者中的表達差異分析 因Hsp90α、AFP和GPC3在肝癌組不同分期表達存在明顯差異，因此，進一 步 以Hsp90α為觀察對象，探討其在HCC未轉移及轉移患者中的表達情況。結果顯示，轉移病例組血漿Hsp90α顯著高于未轉移組（P=0.003）。見圖 1。

2.3 HCC組不同預后情況患者圍介入期血清Hsp90α、AFP和GPC3水平比較 見表3。

表3 HCC組不同預后情況患者圍介入期血清Hsp90α、AFP和GPC3水平比較［g/L，（）］

表3 HCC組不同預后情況患者圍介入期血清Hsp90α、AFP和GPC3水平比較［g/L，（）］

注：死亡組各時間點HSP90ɑ、AFP、GPC3與生存組比較P均＜0.05

時間/檢測項目 死亡組（n=102） 生存組（n=91）T0 Hsp90α 0.059±0.023 0.022±0.007 AFP 422.52±41.27 301.18±32.67 GPC3 212.27±22.34 103.54±10.28 T1 Hsp90α 0.063±0.013 0.066±0.012 AFP 592.52±19.55 487.88±12.01 GPC3 232.33±20.15 122.34±9.73 T2 Hsp90α 0.080±0.020 0.062±0.006 AFP 701.30±33.31 665.22±22.03 GPC3 241.77±22.54 189.31±10.00 T3 Hsp90α 0.084±0.013 0.059±0.010 AFP 752.42±29.55 671.18±14.57 GPC3 432.28±20.33 388.27±17.48 T4 Hsp90α 0.089±0.023 0.052±0.008 AFP 769.52±11.99 701.09±11.14 GPC3 642.27±25.04 520.54±18.01

2.4 Hsp90α、AFP及GPC3單一及聯合檢測對HCC的診斷價值 單一指標檢測診斷時，Hsp90α的敏感度最高（74.20%），但GPC3的特異度最高（82.06%）；兩個聯合檢測方案中，Hsp90α/GPC3方案的敏感度 最 高（89.22%），AFP+GPC3和 Hsp90α+AFP方案特異度較高（92.44%，84.05%）；三項聯合檢測時，Hsp90α/AFP/GPC3方案的敏感度較高（92.3%），Hsp90α+AFP+GPC3特異度較高（97.68%）。肝癌患者血清Hsp90α、AFP、GPC3單項檢測，Hsp90α的敏感性最高，而特異性GPC3最高，三者聯合檢測的靈敏度提高至92.3%，較其單項檢測的敏感度差異有統計學意義。

2.5 利用 ROC曲線評價Hsp90α、AFP、GPC3單項及3項聯合檢測對肝癌的診斷價值 單項檢測時，Hsp90α的曲線下面積（AUC）為0.8931，AFP的AUC為 0.776，GPC3的 AUC為 0.728。 以 Hsp90α、AFP、GPC3水平為檢驗變量，以診斷結果為狀態變量，用向后Backward Condition方法做Binary Logistic回歸分析，計算各個體預測值的變量PRE。對上述Logistic回歸模型行似然比檢驗，結果顯示差異有統計學意義（χ2=129.83，P＜0.001），通過做三者聯合檢測的ROC曲線分析。Hsp90α、AFP及GPC3聯合檢測時AUC為0.923，均高于單項檢測，但三項聯合與Hsp90α單獨檢測AUC差異無統計學意義（Z=1.34，P=0.15）。在肝癌檢測時，3項聯合檢測優于單項檢測，而Hsp90α優于AFP及GPC3。

3 討論

AFP是目前臨床上應用最早，最基礎的HCC血清學標志物，因部分HCC患者的AFP值低表達，易導致肝癌的漏診和誤診。另外，約30%的肝硬化、慢性肝病等非HCC患者的AFP水平也可以不同程度的升高［5］，故特異性低，臨床使用多項腫瘤標志物進行聯合檢測勢在必然。

Hsp90α是一種腺嘌呤核苷三磷酸依賴的具有分子伴侶功能的蛋白質，通過其與信號通路中的關鍵蛋白酶相互作用，調控細胞的生存、分化及代謝等重要生理過程。高水平表達的HSP90可促進腫瘤的發展，促進癌癥細胞的擴散和轉移，影響患者的預后和轉歸。

本資料結果顯示，各實驗組Hsp90α水平均高于正常對照組，且HCC組高于肝硬化組，差異均有統計學意義，提示Hsp90α水平檢測可用于HCC的診斷或早期診斷，同時也可作為兩者的鑒別診斷。結果顯示，本資料納入的193例HCC患者，依據其病理分期進行分組，隨著患者分期增加，Hsp90α、AFP及GPC3的表達水平均顯著升高，提示高表達指標可能與HCC的病理分期具有密切聯系。現有臨床HCC的病理分期主要依靠組織活檢確認，因取材等因素不適于病情治療及轉歸監測，多種血清學標志物聯合檢測成為可能。

由于單一標志物的敏感性及特異性均無法達到臨床診斷需要，多種腫瘤標志物聯合檢測可彌補了這一缺陷。敏感性提高至92.3%，與單項檢測比較差異有統計學意義（P＜0.05）。同時通過ROC曲線分析，Hsp90α對肝癌診斷的敏感性高于AFP和GPC3，三者聯合檢測對肝癌診斷的敏感性顯著高于任何單一檢測，說明三項指標聯合后能有效降低漏診率。

綜上所述，血清Hsp90α、AFP及GPC3聯合檢測能夠彌補單項檢測的缺陷，提高HCC的陽性檢出率，對HCC早期診斷或鑒別診斷、減少漏診具有臨床應用價值。在臨床實際應用中，須注意聯合檢測存在的缺點是假陽性率偏高。所以一定要結合病理、CT、B超等檢查結果綜合考慮，剔除假陽性患者，盡量減少誤診和漏診。