濟寧地區醬菜中乳酸菌的篩選與鑒定

宮華 姜建 王倫 吳晗 陳子鈺 李星雨 解瑞寧

摘 要：目的：對從醬菜中篩選出的優質乳酸菌進行形態學觀察、探究其最適生長pH，并篩選出降解亞硝酸鹽能力強的乳酸菌株。方法：采用平板計數法進行菌數測定，采用革蘭染色法對乳酸菌進行觀察，利用分光光度法測定乳酸菌在不同PH培養液中OD值。結果：從醬菜中提取出的乳酸菌為革蘭氏陽性菌，最適生長pH為6。最終分離得到降解亞硝酸鹽能力強的LD-1乳酸菌。結論：醬菜含有乳酸菌并成功篩選出降解亞硝酸鹽能力強的乳酸菌。

關鍵詞：醬菜;乳酸菌;革蘭染色法;平板計數法;濟寧

Abstract：Objective： To observe the morphology of high quality lactic acid bacteria screened from pickles， to explore the optimal growth pH， and to screen out lactic acid bacteria with strong ability of degrading nitrite. Methods： Plate counting method was used to determine the number of bacteria， Gram staining method was used to observe the lactic acid bacteria， and the OD value of lactic acid bacteria in different pH culture medium was determined by spectrophotometry. Results： The Lactobacillus extracted from pickles was gram-positive， and the optimum growth pH was 6. Finally， LD-1 lactobacillus with strong ability of degrading nitrite was isolated. Conclusion： There are Lactobacillus in pickles and lactobacillus with strong ability of degrading nitrite has been successfully screened.

Key words：Pickles; Lactobacillus; Gram staining; Plate count method; Jining

乳酸菌是日常生活中的常見菌，其在人體許多生理活動中起著重要作用[1-4]。在食品中加入乳酸菌，可以提高食品的營養價值、延長保存時間以及改善食品口感。亞硝酸鹽廣泛存在于人們生活的環境中，土壤、水流以及各種生物體內都含有硝酸鹽和亞硝酸鹽，很多食品中均含有亞硝酸鹽，但含量不高，對人體影響不大，然而食品經過加工后亞硝酸鹽的含量會大大增加[5-6]。目前泡菜、醬菜的制作方法比較落后，亞硝酸鹽含量高。亞硝酸鹽含量問題已成為影響醬菜產業進步與發展的“絆腳石”。醬菜中乳酸菌對亞硝酸鹽有降解作用，因此篩選出降解亞硝酸鹽能力強的乳酸菌株對人們的生產生活具有重要意義。濟寧醬菜口味好，質量高，享譽全國。因此，本文希望從濟寧醬菜中提取出降解亞硝酸鹽能力強的乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 樣品

濟寧市售的本地醬菜樣品

1.2 培養基

MRS固體培養基：葡萄糖10 g，瓊脂20 g，蛋白胨5 g，KH2PO42 g，酵母膏2 g，碳酸鈣粉末15 g，蒸餾水1 000 mL，PH7.0。液體培養基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，KH2PO42 g，酵母膏2 g，蒸餾水1 000 mL，PH7.0。

1.3 試劑

MRS培養基（北京陸橋技術股份有限公司）;碳酸鈣（純度為分析純）;革蘭染色試劑（濟南百博生物技術股份有限公司）;無水對氨基苯磺酸（北京西中化工廠）;鹽酸萘乙二胺（上海化學試劑分裝廠）;生理鹽水;甘油等。

1.4 實驗設備

超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）;高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）;平皿;錐形瓶;接種針;分光光度計;恒溫培養箱;菌落計數儀;吸光光度計;移液槍等。

1.5 乳酸菌的篩選

1.5.1 乳酸菌的分離

從玉堂醬菜提供的醬菜中隨機切取1 g，放入研缽中，加入1 mL生理鹽水，充分研磨，靜置15 min，放入超凈工作臺中。將玉堂醬園醬菜樣品用生理鹽水按10-1～10-3濃度梯度稀釋：準備6個EP管，分別編號1、2、3、4、5、6放于管架上，在EP中配制成不同濃度菌液。

1.5.2 菌落計數

將濃度分別為10-1～10-3的乳酸菌涂布在固體培養基中培養。將培養皿放在培養箱中培養，37 ℃下條件下培養12 h。用平板計數法進行菌落計數。

1.5.3 菌落觀察

在顯微鏡下進行，先對其進行直接鏡檢，再對其進行革蘭染色后再鏡檢。

1.5.4 乳酸菌篩選

從平板中挑選鈣溶圈大的菌株在MRS固體培養基上反復純化篩選。篩選得到乳酸菌，接種到液體培養基中培養。

1.5.5 酸度檢驗

探究乳酸菌的最適生長pH。OD值可用來表示菌液濃度，而菌液濃度的大小則可以表示乳酸菌生長繁殖的速度。配置pH梯度為3、4、5、6、7、8和9的MRS液體培養液，高壓滅菌15 min。按菌液與蒸餾水1∶9的比例配制成10-1濃度的菌液，分別取等量菌液加入不同PH的液體培養基中混勻。置于37 ℃恒溫培養箱中培養。測試24 h、48 h后在450 nm條件下測其OD值。

1.5.6 根據鹽酸萘乙二胺法測定乳酸菌對亞硝酸鹽的降解能力

將篩選出乳酸菌接種于含有適量NaNO2的MRS液體培養基中，同時做空白對照。恒溫培養箱中靜置培養24 h后檢測發酵液中NaNO2的含量。配制對氨基苯磺酸溶液與鹽酸萘乙二胺溶液。取上述4瓶培養液，使用國加標準法測定亞硝酸鹽含量，用分光光度計于538 nm處測吸光度，每個菌株做3份重復。

2 結果與分析

提取碾碎醬菜上清液，在EP管中配制成不同濃度菌液（見表1），并把其涂布在固體培養基中培養，稀釋濃度越高，菌落數量越高（見表2，圖1）;進行形態學觀察，對其中長勢較好的菌落進行鏡檢（見表3）;革蘭染色后乳酸菌被染成了藍紫色，證明乳酸菌是革蘭氏陽性菌（見圖2）。從平板中挑選鈣溶圈大的菌株在MRS固體培養基上反復純化篩選，最終挑選鈣溶圈最大的3株。將篩選到的菌株編號為LD-1、LD-2、LD-3，接種到液體培養基中，篩選得到乳酸菌。

3 乳酸菌的鑒定

3.1 酸度實驗

測試24 h、48 h后乳酸菌在450 nm條件下OD值，發現在48 h的培養周期內，初始pH=6的培養基中乳酸菌一直保持較高的生長性能，繁殖能力最強。結果見表4。

3.2 乳酸菌降解亞硝酸鹽實驗

用挑選出LD-1、LD-2、LD-3號乳酸菌降解亞硝酸鹽，由表5知，與空白對照相比，容量瓶中亞硝酸鈉含量均減少，其中1號容量瓶中亞硝酸鈉含量最低，證明LD-1乳酸菌對亞硝酸鈉分解能力最強。

4 結論

本次實驗成功的從醬菜中提取到乳酸菌為革蘭氏陽性菌，鈣溶圈最大的3株乳酸菌最的適生長pH為6。根據GB/T 5009.33-2008《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的鹽酸萘乙二胺法篩選出了降解亞硝酸鹽能力較強的優良乳酸菌株LD-1乳酸菌。從玉堂醬園提供的醬菜中提取到了乳酸菌，證明其生產的醬菜中亞硝酸鹽含量可能較低，對人體危害程度較小。將篩選出的LD-1乳酸菌應用到醬菜的生產過程的，可提高醬菜口感風味，并減少亞硝酸鹽含量，減少醬菜的腌制時間，提高經濟效益。也可將LD-1乳酸菌應用于生產生活中的其他方面，例如酸奶的制作、入藥等。

參考文獻：

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