HPLC法測定面包中脫氫乙酸的不確定度評定

葛靜微 沈瑩萍 馬芮萍 楊陽

摘 要：評定高效液相色譜法測定面包中脫氫乙酸含量的不確定度。依據(jù)國家計量技術(shù)規(guī)范JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》，建立脫氫乙酸不確定度的數(shù)學(xué)模型，并對各不確定度分量進行分析，計算合成不確定度和擴展不確定度。結(jié)果表明，當(dāng)樣品中脫氫乙酸的含量為0.2547 g·kg-1時，其擴展不確定度為0.0065 g·kg-1（P=95%，k=2），標(biāo)準(zhǔn)曲線配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、加標(biāo)回收、重復(fù)性測量是測量不確定度的主要來源。

關(guān)鍵詞：面包;脫氫乙酸;不確定度;高效液相色譜法

Abstract：Uncertainty of determination of dehydroacetic acid in bread was evaluated by high performance liquid chromatography method. The sources of uncertainty in determination of dehydroacetic acid were analyzed according to the national measurement technical specification JJF 1059.1-2012 Evaluation and expression of uncertainty in measurement. The combined uncertainty and extended uncertainty were calculated by establishing mathematical model. The results showed that the expanded uncertainty was 0.006 5 g·kg-1（P=95%，k=2） when the dehydroacetic acid content was 0.2547 g·kg-1， which was greater caused by preparation of standard solution， curve fitting， standard addition recovery and repeatability of determination.

Key words：Bread; Dehydroacetic acid; Uncertainty; High performance liquid chromatography method

脫氫乙酸又名脫氫醋酸，是一種應(yīng)用廣泛的防腐劑，對霉菌、酵母菌、細(xì)菌具有很好的抑制作用，抑菌效果是苯甲酸的2～10倍，廣泛用于果汁、腐乳、醬菜及糕點中[1]。脫氫乙酸能夠被人體迅速吸收，影響人體的腎臟、肝臟以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)[2]，并可能引發(fā)癌癥[3]。我國食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014中規(guī)定[4]脫氫乙酸在面包中的限量是0.5 g·kg-1。因此，對食品中脫氫乙酸的使用進行監(jiān)管顯得尤為重要，而檢測的準(zhǔn)確性是監(jiān)管的基礎(chǔ)。

不確定度評估是表示檢驗結(jié)果準(zhǔn)確性的重要方式，能夠表明結(jié)果的可信賴程度，是衡量測量結(jié)果的重要指標(biāo)[5-7]，是表征合理地賦予被測量值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，其數(shù)值的大小反映了測量結(jié)果質(zhì)量的高低，并直接與檢驗結(jié)果的合格判定相關(guān)[8]。因此，不確定度的分析評定在日常檢測工作中極為重要，對于面包中脫氫乙酸不確定度評定具有重要意義。

目前，面包中脫氫乙酸含量不確定度評定尚未見報道，本文采用GB 5009.121-2016中樣品前處理方法，高液相色譜法進行檢測，并根據(jù)JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[9]、JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[10]及其他不確定度評定方法對測定結(jié)果進行不確定度分析評定，可為面包中脫氫乙酸含量檢測的實驗室評定不確定度提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：U3000液相色譜儀配熒光檢測器和Chromeleon 7色譜工作站，美國Thermo公司;脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)BW900901-1000-C（1000 μg·mL-1）：壇墨標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心;甲醇（色譜純）：德國默克公司;乙酸銨（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉、正己烷和硫酸鋅均為分析純：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;超純水（電阻率18.2 mΩ·cm-1）：Millipore純水儀制備。

1.2 試驗方法

參考GB 5009.121-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測定》。

1.2.1 樣品前處理

稱取2 g（精確至0.001 g）試樣，置于25 mL離心管中，加入約10 mL水、5 mL硫酸鋅溶液（120 g·L-1），用氫氧化鈉溶液（20 g·L-1）調(diào)pH至7.5，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。置于離心管中，超聲提取10 min，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入10 mL正己烷，振搖1 min，靜置分層，棄去正己烷層，加入10 mL正己烷重復(fù)進行一次，取下層水相置于離心管中，4 000 r·min-1離心10 min。取上清液過0.22 μm有機濾膜，供高效液相色譜測定。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）;流動相：甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨（體積比為10∶90），流速為1.0 mL·min-1，等度洗脫;紫外檢測器：波長為293 nm。

1.2.3 定量方法

用濃度為1 000 μg·mL-1的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液逐級稀釋，配成濃度分別為1、2、5、10 μg·mL-1和20 μg·mL-1的校準(zhǔn)曲線溶液，外標(biāo)法定量。

1.2.4 脫氫乙酸含量的計算公式

按照式（1）計算脫氫乙酸的含量：

（1）式（1）中，X-試樣中脫氫乙酸的含量，單位g·kg-1;C-試樣溶液中脫氫乙酸的質(zhì)量濃度，單位μg·mL-1;C0-空白試樣溶液中脫氫乙酸的質(zhì)量濃度，單位μg·mL-1;V-試樣溶液總體積，單位mL;m-稱取試樣的質(zhì)量，單位g;1000-換算因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度及來源分析

不確定度評定參數(shù)分為A類和B類，A類評定是指在規(guī)定測量條件下測得量值用統(tǒng)計分析的方法進行測量不確定度分量的評定，B類評定是指用不同于測量不確定度A類評定的方法對測量不確定度分量進行評定[9，11]。通過對全過程的分析，脫氫乙酸不確定度的主要來源有：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品稱量、樣品定容、重復(fù)性測定和加標(biāo)回收率等。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度的不確定度Urel（1）（B類）

查標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，脫氫乙酸濃度為1 000 μg·mL-1，不確定度為2%，按均勻分布計算，包含因子k=2，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：（2）

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制的不確定度

（1）標(biāo)準(zhǔn)中間液配制的不確定度Urel（2）（B類）。標(biāo)準(zhǔn)中間液配制過程中使用20 μL的移液器吸取

20 μL的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用水定容至10 mL容量瓶，20 μL的移液器容量允許誤差4.0%，按均勻分布考慮，k=，移液器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（移液器）為：

（3）根據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[12]，玻璃量器引入的不確定度服從三角分布，包含因子k=，10 mL容量瓶（A級）最大允許差為±0.020 mL，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（4）標(biāo)準(zhǔn)中間液配制的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制的不確定度Urel（3）（B類）。用1 000 μL移液器分別移500 μL、100 μL標(biāo)準(zhǔn)中間液（20 μg·mL-1）于1mL容量瓶中，用水定容，用250 μL移液器移250 μL標(biāo)準(zhǔn)中間液（20 μg·mL-1）于1 mL容量瓶中，用水定容，再用100 μL移液器移取50 μL標(biāo)準(zhǔn)中間液（20 μg·mL-1）于1 mL容量瓶中，用水定容，配成濃度分別為1、2、5、10 μg·mL-1和20 μg·mL-1的校準(zhǔn)曲線溶液。該過程涉及容量瓶、移液器引起的不確定度。

1 mL容量瓶（A級）最大允許差為±0.010，服從三角分布，k=，5個容量瓶相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

1 000 μL移液器吸取500 μL時容量允許誤差±1.0%，吸取100 μL時容量允許誤差±2.0%，250 μL移液器吸取250 μL時容量允許誤差±1.5%，100 μL移液器吸取50 μL時容量允許誤差±3.0%，按均勻分布，k=，則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合引入的相對不確定度Urel（4）（A類）

分別測定濃度為1、2、5、10 μg·mL-1和20 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液2次，計算平均值，得到相應(yīng)的峰面積Y，結(jié)果見表1。

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，擬合得到線性回歸方程及R2。對樣品進行兩次平行測定，得到樣品濃度平均值C0=10.2541 μg·mL-1，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度平均值C=7.6 μg·mL-1。由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度式（12）中，S為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S=0.028 19;k為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率，k=0.437 7;p為對的測定次數(shù)，p=2;n為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液點的測定次數(shù)，n=5;C為標(biāo)準(zhǔn)工作液的平均濃度，C=7.6 μg·mL-1;（C0-C）=105.146 6;（Ci-C）=241.2。

2.3 樣品前處理引入的不確定度Urel（5）（B類）

2.3.1 樣品稱量產(chǎn)生的不確定度

2.3.2 樣品定容產(chǎn)生的不確定度

樣品經(jīng)稱量、加水和硫酸鋅，氫氧化鈉調(diào)pH后，定容于25 mL，25 mL容量瓶（A級）容量允差為±0.03 mL，服從三角分布，k=，由容量瓶定容產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度由樣品前處理引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.4 重復(fù)測量產(chǎn)生的不確定度Urel（6）（A類）

對面包中脫氫乙酸含量進行8次重復(fù)性測定，結(jié)果分別為0.253 6、0.255 1、0.253 9、0.251 6、0.254 3、0.256 5、0.255 4 g·kg-1和0.2574 g·kg-1，平均值X為0.2547 g·kg-1，標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)不確定度，由重復(fù)測量產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.5 加標(biāo)回收引入的不確定度Urel（7）

按照1.2.1試驗方法對樣品進行添加回收率試驗，在5 μg·mL-1添加水平下，進行5次平行試驗，添加回收率分別為93.41%、90.53%、91.54%、92.06%和91.35%，平均值為X=91.78%，標(biāo)準(zhǔn)偏差S為0.0107，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.6 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴展不確定度

2.6.1 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

各相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量合成：

2.6.2 擴展不確定度

3 測量結(jié)果及不確定度報告

高效液相色譜法測定面包中脫氫乙酸的結(jié)果報告為：

4 結(jié)論

實驗測得當(dāng)面包中脫氫乙酸含量為0.254 7 g·kg-1時，其測量不確定度為（0.254 7±0.006 5）g·kg-1（k=2，P=95%）。

面包中脫氫乙酸含量的測定過程中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品前處理、重復(fù)性測定、加標(biāo)回收率等均會引入不確定度，通過分析發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、加標(biāo)回收、重復(fù)性測量是測量不確定度的主要來源。

因此，在實際檢測過程中要定期對設(shè)備進行計量檢定、期間核查與維護保養(yǎng)工作[13];要嚴(yán)格把控標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和樣品測量的過程，要加強操作人員的培訓(xùn)，提高操作技能，尤其是標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程，使用精密度較高的量具、準(zhǔn)確操作，以減少樣品測量過程中的誤差，保證測量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

參考文獻：

[1]陳丹萍，褚慶華，楊富春，等.紫外分光光度法快速測定調(diào)味品中脫氫乙酸含量[J].中國食品添加劑，2015（4）：195-198.

[2]趙 欣，張 強.高效液相色譜法測定面包、餅干等焙烤類食品中的脫氫乙酸[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2018，9（13）：3464-3468.

[3]Zhang Y M， Du Y F， Yin J， et al.Determination and depletion of dehydroacetic acid residue in chicken tissues[J].Food additives & contaminants. Part A， Chemistry， analysis， control， exposure & risk assessment，2012，29（6）：918-924.

[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.

GB 2760-2014 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[5]潘拾朝，黎小蘭.氣相色譜測定大蒜精油軟膠囊中大蒜素含量的不確定度評定[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2020，11（1）：275-279.

[6]陳 晨，陳 妍，倪煒華，等.高效液相色譜法測定食品中脫氫乙酸的不確定度評定[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2019，10（9）：2660-2663.

[7]李 珊，楊 寧，胡廷皓，等.超高效液相色譜法測定配制酒中糖精鈉的不確定度分析[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2018，9（19）：5109-5113.

[8]劉麗莉.高效液相色譜法測定飲料中苯甲酸及不確定度評定[J].食品安全導(dǎo)刊，2018（33）：80-81.

[9]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.全國法制計量管理計量技術(shù)委員會.JJF 1059.1-2012 測量不確定度評定與表示[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

[10]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.JJG 196-2006 常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].北京：中國計量出版社，2007.

[11]李 雪，張 玉，王君虹，等.食用油中苯并（α）芘含量測定的不確定度評估[J].糧油食品科技，2019，27（6）：102-108.

[12]中國合格評定國家認(rèn)可委員會.CNAS-GL06：2019 化學(xué)分析中不確定度的評估指南[S].2019.

[13]徐 可，朱 娜，郝 偉，等.HPLC法測定鹽酸二甲雙胍片的含量及測量不確定度評定[J].分析儀器，2019（5）：75-81.