黃芪改善衰老小鼠生殖功能的抗氧化機制研究

朱嵩岳，伯 樂，楊光照，尹 娜，吳晨婷，茅彩萍

（蘇州大學附屬第一醫院生殖醫學中心，江蘇 蘇州 215006）

人類女性生殖系統比絕大部分機體系統衰老得更迅速，生殖能力與年齡呈負相關[1]。隨著年齡的增長，卵母細胞、卵丘細胞和卵泡液中活性氧增加和抗氧化水平降低引起女性生殖系統氧化應激壓力增高，生育能力降低[2]。目前，臨床主要治療手段有免疫治療、內分泌治療等，有關中醫藥的治療較少。黃芪（AS）在臨床常用于防治免疫功能紊亂性疾病、心腦血管疾病、腫瘤等多種疾病，療效確切[3]。黃芪可發揮抗衰老作用，可能是通過抗氧化、調節免疫功能、改善衰老基因和相關酶表達、抑制端粒酶縮短等作用機制而實現[4－5]，但其對女性氧化應激和卵巢生殖功能方面的作用未見報道。現代藥理學研究表明，黃芪的安全有效劑量范圍為9 ～30 g[6]。故本研究中選取黃芪平均治療量為20 g，按體表面積換算，小鼠用量為400 mg／kg。D－半乳糖在半乳糖氧化酶作用下分解成過氧化氫和醛糖，導致機體活性氧和超氧自由基累積，氧化應激增加，造成組織和細胞損傷，是用于構建衰老小鼠的常用藥物[7]。本研究中探討了黃芪對卵巢衰老生殖功能的影響及機制，為臨床治療卵巢衰老提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：ETC811 型基因擴增儀（蘇州東勝興業科學儀器有限公司）；Gene Amp9700 型Q－PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）；TEC －VEMJ2 型全自動組織包埋機（日本櫻花公司）。

試藥： D－半乳糖（D－Galaactose，T0591，批號為20160406，美國Targrt Mol 公司）；黃芪Astragalus membranaceus （Fisch.） Bge 干燥根提取物（b21616 －1g，批號為20160605，上海源葉生物科技有限公司）；孕馬血清促性腺激素（PMSG，P9970，批號為20161012，北京索萊寶科技有限公司）；人絨毛膜促性腺激素（HCG，BM0066，批號為20160815，武漢博士德生物工程有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）檢測試劑盒( 蘇州綠葉日用品有限公司)；RNeasy Mini Kit（74101，批號為A180502A，美國Qiagen 公司）；逆轉錄－聚合酶 鏈式反應(RT－PCR)試劑盒（RR047A，批號為157019548， 日 本 Takara 公 司）； 引 物（ 批 號 為HG1811290022，南京銳真生物公司）。

動物：60 只SPF 級ICR 雌性小鼠和10 只SPF 級ICR 雄性小鼠，8 周齡，體質量（22.1 ±2.9）g，購自昭衍（蘇州）新藥研究中心有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（蘇）2018 －0006。自由飲食飲水，期間喂食標準顆粒飼料，飼養環境溫度為18 ～25 ℃，相對濕度為40% ～60%，光照周期12 h ∶12 h。所有動物實驗方案均按蘇州大學第一附屬醫院倫理委員會規定進行。

1.2 方法

動物模型建立：選取60 只8 周齡ICR 雌鼠，體質量均在（22 ±3）g，隨機分為空白對照（CON）組、衰老模型（ D － gal）組、黃芪治療組（ D － gal ＋AS）組，每組20 只。在相同環境下飼養，飼料和水均經過滅菌處理。D －gal 組皮下注射D－gal[（200 mg／（kg·d）]42 d，超純水灌胃（每10 g 體質量0.2 mL）30 d，小鼠出現精神萎靡、毛色枯黃、行動遲緩等現象為造模成功；空白對照組注射與D －gal 組等體積的生理鹽水42 d，超純水灌胃（每10 g 體質量0.2 mL）30 d；D －gal ＋AS 組皮下注射D－gal[200 mg（kg·d）]42 d，黃芪[400 mg／（kg·d）]灌胃（每10 g 體質量0.2 mL）30 d。

體外受精實驗：造模后，各組均取6 只小鼠腹腔注射PMSG 0.1 mL（5 U），48 h 后，注射HCG 0.1 mL（5 U）。在注射PMSG 后第4 天清晨9：00，處死小鼠，取出卵丘－卵泡復合物；同時，處死雄鼠，取附睪尾內精子在體外與卵丘－卵泡復合物結合6 h 后置二氧化碳(CO2)培養箱（CO2體積分數為5%，溫度為37 ℃）培養，并將受精卵體外培養至囊胚階段，觀察受精卵及各階段胚胎情況，計數并比較各組的二細胞數、四細胞數及囊胚數。

血清和卵巢SOD 和MDA 檢測：其余小鼠頸部脫臼法處死后收集血樣，離心，取上清液；同時，取卵巢組織，迅速用生理鹽水洗凈，在冰上用小組織剪剪碎，放入勻漿管，用勻漿機勻漿，取上清液；上清液行SOD 活性、MDA 含量測定。操作方法均嚴格按試劑盒說明書進行。

囊胚相關氧化應激基因mRNA 表達檢測：用研缽在液氮環境下將體外培養的囊胚組織研磨成粉末，放入1.5 mL 無RNA 酶離心管內，用RNeasy Mini Kit 試劑盒提取RNA，用RT －PCR 試劑盒逆轉錄為cDNA，用于目的基因擴增，用Q －PCR 儀連續熒光檢測擴增，程序設定為UDG 酶激活50 ℃，時間2 min，預變性溫度95 ℃，時間2 min；變性溫度95 ℃，3 s，退火、延伸，溫度60 ℃，30 s，持續40 個循環，于60 ℃處收集熒光，每個樣本均以β－actin 作為對照，行三復孔檢測。采用Graph Pad Prism7 軟件進行分析。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0 統計學軟件分析，行LSD － t 檢驗和單因素方差（ANOVA）分析。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

連續造模42 d 后，各組小鼠均未出現嘔吐、拒食等病理情況。

2.2 促排卵后體外受精結果

3 組小鼠平均排卵數無統計學差異（P ＞0.05）；與CON 組相比，D －gal 組小鼠平均二細胞數、四細胞數及囊胚數均顯著減少（P ＜0.05）；D－gal ＋AS 組中二細胞數、四細胞數及囊胚數較D－gal 組顯著增加（P ＜0.05）。詳見表1。

表1 3 組小鼠排卵數及早期胚胎各階段正常胚胎數（± s，n ＝6）

表1 3 組小鼠排卵數及早期胚胎各階段正常胚胎數（± s，n ＝6）

注：與D －gal 組相比， P ＜0.05。圖1 和圖2 同。

組別CON 組D－gal 組D－gal ＋AS 組排卵數29.55±2.84 25.16±3.51 32.12±4.05二細胞數20.91±4.48 16.27±4.27 26.50±5.43四細胞數20.61±4.18 14.27±3.69 23.38±5.74囊胚數16.05±6.34 9.66±1.66 17.77±3.99

2.3 小鼠血清、卵巢、囊胚中SOD 和MDA 水平

D －gal 組小鼠血清中SOD 水平較CON 組顯著降低（P ＜0.05），D－gal ＋AS 組較D－gal 組SOD 水平顯著升高；D－gal 組中MDA 水平較正常組顯著升高（P ＜0.05），D － gal ＋AS 組MDA 水 平 較 D － gal 組 顯 著 降 低（P ＜0.05）。 D－gal 組小鼠卵巢組織中SOD 水平較CON 組顯著降低（P ＜0.05），D －gal ＋AS 組較D－gal組SOD 水平顯著升高（P ＜0.01）；D－gal 組中MDA 水平較CON 組顯著升高（P ＜0.05），D －gal ＋AS 組MDA水平較 D－gal 組顯著降低（P ＜0.05）。 D －gal 組與CON 組相比，囊胚SOD1和SOD2基因表達水平顯著降低（P ＜0.05）；與D －gal 組相比，D－gal ＋AS 組中囊胚SOD1和SOD2表達水平顯著升高（P ＜0.05）。詳見圖1 和圖2。

圖1 3 組小鼠血清、卵巢、囊胚中SOD 和MDA 水平（n ＝14）

圖2 囊胚中SOD1 和SOD2 表達水平（n ＝14）

3 討論

高齡所伴隨著的卵巢衰老是影響生殖健康的重要原因[1]。卵巢衰老直接影響卵子質量，而卵子老化導致卵母細胞線粒體結構異常、紡錘體及染色體排列異常、活性氧（ROS）增加等問題，進一步導致卵母細胞質量下降，可能出現低生育率、胚胎發育異常和先天性缺陷等生殖相關疾病，其中最主要的原因是ROS 增加[8－9]。機體一般處于ROS 平衡狀態，即抗氧化水平與氧化水平持平，但當抗氧化水平降低或氧化水平增高時，則會產生過多的ROS，會對機體中的DNA、脂質等大分子造成損害[10]。脂質氧化最終產物為MDA，是機體氧化程度判定的重要指標之一，過量的MDA 會破壞細胞膜中的不飽和脂肪酸，D －半乳糖可能產生過量的超氧陰離子和過氧化氫，導致脂質過氧化物在細胞膜中過量沉積，從而增加了MDA 的含量[11]。SOD 是機體最重要的抗氧化酶之一，是抵擋ROS 的第一道防線，催化超氧化物向過氧化氫轉化，對于正常細胞功能有重要意義[12]。當MDA代謝過量和SOD 水平下降時，則表示機體氧化應激水平增強，ROS 增加，引發衰老[13]。

黃芪多糖、黃芪提取物均有抗衰老、降低氧化應激水平的功能[14]，主要是通過清除多余的ROS 及改善線粒體功能障礙等途徑，最終改善機體能量代謝[15]。本研究結果顯示，黃芪改善了小鼠胚胎的發育能力，增強了抗氧化酶的活性，且減少了氧化代謝產物的減少，表明黃芪改善了衰老小鼠卵母細胞的氧化應激狀態，增強了卵母細胞的抗氧化能力，促進受精卵的成熟。初步推測與相關基因上調有關。

褪黑素可通過降低生殖系統氧化應激、去除ROS及抗卵母細胞凋亡等途徑實現改善小鼠生殖功能的作用，其主要功能蛋白為SOD2；同時，SOD2蛋白將體內代謝生成的超氧化物轉變成過氧化物，在過程中產生的超氧陰離子和過氧化氫對卵泡發育也起到了關鍵作用[16]。體外培養的囊胚在黃芪的作用下，SOD1和SOD2基因表達增加，表明黃芪通過增加SOD 基因的表達也發揮了類似褪黑素的功能。目前，SOD1的功能尚不明確，但應注意卵丘細胞SOD1蛋白活性降低會導致體外受精－胚胎移植術（IVF－ET）成功率下降[17]，可推斷黃芪可能會影響IVF －ET 的成功率，但仍需后續研究進一步證實。

綜上所述，黃芪可能通過增強抗氧化基因的表達，降低衰老小鼠的全身氧化應激作用，改善其生殖功能，均為臨床黃芪治療卵巢衰老提供了理論基礎。