卵母細胞的脫顆粒時間對短時受精后胚胎質量和妊娠結局的影響*

彭禮繁 張小建 廖梅旭 李曉潔 余 鯤 龍華洋

四川省醫學科學院·四川省人民醫院輔助生殖醫學中心（四川成都 610072）

使用短時受精進行體外受精(IVF)時，卵子脫顆粒細胞時間何時為最佳目前尚存在爭議[1]。脫顆粒細胞過早可能會增加胚胎的多精受精率，影響胚胎基因表達與基因甲基化修飾，進而影響胚胎質量；脫顆粒細胞時間過晚可能導致少數患者受精失敗，失去補救卵胞漿內單精子顯微注射Intracytoplasmic sperm microinjection(ICSI)的最佳時機。本研究觀察了IVF 去除顆粒細胞和保留顆粒細胞發育的胚胎的發育參數，為短時受精及早補救ICSI 周期移植胚胎的選擇提供參考依據。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析了2018年1月～2018年12月在我院行IVF 短時受精第3 天移植的323 例不孕患者的臨床資料。患者納入標準：（1）年齡25～35 歲；（2）獲卵數為5～15 枚；（3）病因為女方不孕且男方精液正常。將患者按照卵母細胞不同的脫顆粒時間分為A組103 例和B組220 例，A組年齡(33.51±4.34)歲；B組年齡(32.43±4.23)歲。

二、研究方法

1. 促排卵及取卵：選擇本中心常規的促排卵方案，包括激動劑長方案和拮抗劑方案，使用卵泡刺激素（FSH，果納芬，默克雪蘭諾，瑞士）進行卵巢刺激。當有3 個卵泡直徑達到18～20mm 時注射human choionic gonadotophin (HCG)（艾澤，250μg/ 支，Serono，瑞士）250μg，此后38h 經陰道超聲引導下取卵。

2.受精方法：取卵后3h 左右進行雙井皿法授精。內井中為1mL 的G-IVF(Vitrolife)，加入10000～20000條精子(精液處理均為密度梯度法)，加入卵子10 枚左右。精卵共孵育3.5h 后用巴氏德吸管隨機取出5 枚左右卵母細胞，使用剝卵針(COOK)輕輕吹打去除卵子周圍部分顆粒細胞，置于新鮮培養液微滴中(G-IVF)中觀察第二極體出現情況；若＞50% 的卵母細胞出現第二極體則判定受精成功。將剩余的卵母細胞保留顆粒細胞從內井液滴移出，放入另一新鮮的培養液中繼續培養(G-IVF)。受精后20h 后使用剝卵針(COOK)全部去除顆粒細胞，觀察受精情況，并進行原核評分。

3.胚胎的觀察和評估：IVF 后的16～18h (受精后第1 天)觀察卵母細胞的受精情況，并換液，繼續用卵裂期培養基培養，第3 天觀察卵裂球的分裂情況，根據胚胎卵裂球數目、 細胞質均一性、 碎片多少等進行胚胎評分，我們將卵裂球數目為6 或8，評級為II 的胚胎定義為優質胚胎。在移植日挑選質量最好的1～2 枚胚胎進行移植，其他胚胎轉移至囊胚培養液（G2，Vitrolife，瑞典） 中繼續培養。如果移植當日因特殊情況不能移植者，將此1～2 枚胚胎冷凍保存或繼續培養。在受精后第5日或第6日觀察囊胚形成情況，挑選內細胞團質量達到A 或B 級的囊胚進行冷凍，C 級的囊胚放棄，滋養細胞層的質量不限。

4. 妊娠結局的判斷及觀察指標： 移植后第7日檢測血清HCG 水平，HCG>5U/L 判斷為生化妊娠； 移植后4 周行超聲檢查，超聲下可見胎心及胎囊者判斷為臨床妊娠。種植率＝著床胚胎數/ 移植胚胎數×100%；臨床妊娠率＝臨床妊娠例數/移植周期數×100%。

5. 分組標準：根據移植胚胎來源分組：A組為移植受精后3h 去除顆粒細胞的患者，B組為移植受精后3h并在20h 去除顆粒細胞的患者。

三、統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。數據以均數±標準差或率(%)表示，組間兩兩比較采用t 檢驗或卡方檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義，P<0.01 為差異有極顯著統計學意義。

結 果

1.患者基本情況比較

兩組患者在年齡、不孕年限、原發/繼發比例、促性腺激素用量、促性腺激素使用天數、獲卵數、移植日內膜上均無統計學差異(P>0.05)。結果見表1。

2.患者的胚胎質量及妊娠結局比較

兩 組 患 者 在MII 卵 數、2PN 卵 數、1PN 卵 數、2PN分裂數、優質胚胎數、移植胚胎數等胚胎發育參數方面兩組間沒有顯著性差異（P>0.05）；但在3PN 卵數上兩組間差異極顯著（P<0.01），在種植率和臨床妊娠率上兩組間差異顯著（P<0.05）。結果見表1。

討 論

卵母細胞周圍包裹著的大量顆粒細胞，參與構成卵母細胞發育的微環境。兩者為結構和功能上的統一整體，涉及復雜的雙向信號傳導系統和分子水平機制，顆粒細胞對卵母細胞的發育成熟有重要作用，同時調控受精及胚胎發育過程，大量研究表明顆粒細胞的一些基因能夠預測胚胎發育潛能及臨床妊娠結局[2]。單卵母細胞的顆粒細胞的Growth differentiation factor-9(GDF-9) 與Bone morphogenetic protein-15(BMP-15)mRNA 能夠評價卵母細胞的質量和預測卵母細胞發育潛能[3]。有研究認為[4]將未成熟卵母細胞與卵丘顆粒細胞共培養能夠促使卵子體外成熟，從而增加優質胚胎數，改善妊娠結局，減少周期取消率。有研究結果[5]表明，將MI 期和GV 期卵母細胞與顆粒細胞共同培養后能夠增加總成熟率，MI 期來源獲得的優質胚胎率較高，表明顆粒細胞共培養能夠促進卵母細胞的核質同步化。目前輔助生殖技術使用控制性超促排卵在非生理狀態下募集較多的卵泡發育，可能會影響卵子的質量，損害線粒體功能，影響細胞骨架，從而導致卵母細胞的核質發育不同步，其核的成熟先于質的成熟。

表1 兩組患者的臨床資料和胚胎發育質量比較

體外受精實驗結果表明[6]，就人和動物的卵母細胞恢復減數分裂和受精后的發育潛能而言，有顆粒細胞包圍的卵母細胞明顯高于無顆粒細胞包圍的卵母細胞，有較多顆粒細胞包圍的卵母細胞高于只有少量顆粒細胞包圍的卵母細胞，這也表明顆粒細胞能提供卵母細胞成熟所必需的物質，并且這種物質依賴于顆粒細胞包圍卵母細胞的數量和范圍。有研究認為[7]，顆粒細胞可以分泌對早期胚胎發育有利的物質，如生長因子等；其可作為共培養細胞促進胚胎的發育；也可以通過代謝去除胚胎體外微環境中的不利于胚胎發育的物質，如重金屬二價離子等。有研究認為[8]，顆粒細胞與卵母細胞之間存在的細胞間復雜的縫隙連接機制，對卵泡的發育及胚胎的質量都非常重要。關于短時受精早去除顆粒細胞對胚胎基因表達與甲基化修飾的影響以及顆粒細胞對胚胎后期發育潛能和著床率的影響，目前還無定論[9]。

有研究認為[10]，常規IVF 短時受精后6h 通過剝除顆粒細胞來觀察第二極體是否排出可以預測卵子受精與否，通過早補救ICSI 可以有效地預防卵子受精失敗，從而提高臨床妊娠率。有研究認為[11]，脫顆粒細胞的時間過早會導致胚胎的多精受精率比例偏高。其原因可能是：在受精早期，過早脫顆粒細胞的機械操作很可能對卵母細胞外周的透明帶造成損傷，如果造成透明帶上的微小缺口，這會影響卵胞漿內的皮質反應和透明帶反應，從而增加多精入卵的機會；顆粒細胞上的某些特有成分可以降低多精受精率，如果過早去除顆粒細胞會使其微環境發生改變，也可能增加多精受精的機會。這與本文的研究結果一致。此外，在配子形成早期，生殖細胞被抹除甲基化印跡，在精卵成熟過程中重新甲基化獲得印跡，并被保護以維持其正確的劑量效應。印跡基因的甲基化等表觀遺傳修飾主要發生于配子發育階段，而此期恰為短時受精的脫顆粒細胞時期，過早剝除顆粒細胞，是否增加對卵母細胞的額外影響，干擾卵母細胞或早期胚胎中母親基因印跡的建立和維持，這還有待于進一步的研究[12]。

有研究對常規IVF 與短時受精的胚胎發育參數進行了比較，發現短時受精不能提高胚胎著床率和臨床妊娠率[13]，另外一些研究的結論則與之相反[14-15]。本研究比較了短時受精后去除顆粒細胞與保留顆粒細胞所發育的胚胎發育參數和妊娠結局，結果顯示：移植短時受精后20 h 去除顆粒細胞發育的胚胎與短時受精后3h去除顆粒細胞發育的胚胎著床率和臨床妊娠率之間有統計學差異。這也提示了卵母細胞周圍的顆粒細胞不僅與配子受精有重要關系，而且對胚胎的后期發育潛能也具有重要意義，這也為移植時胚胎選擇提供了一個參考指標.

綜上所述，在短時受精去除顆粒細胞判斷受精與否時，在確保能夠正確判斷受精的前提下盡可能減少脫顆粒細胞的卵母細胞數量。在新鮮移植過程中優先選擇移植短時受精3h 并保留顆粒細胞并在20h 去除顆粒細胞發育來胚胎，這有助于提高胚胎的著床率和臨床妊娠率，改善妊娠結局。