利用實時剪切波超聲彈性成像定量評價陰莖平滑肌含量變化的實驗研究*

邢晉放

復旦大學附屬浦東醫院/上海市浦東醫院超聲醫學科（上海 201399）

陰莖海綿體是調控勃起功能的重要組織，在海綿體中，平滑肌組織約占40%-52%[1]，平滑肌的功能是完成陰莖的舒張及勃起，因此，平滑肌的含量對勃起功能產生直接影響，定量評價陰莖組織平滑肌的含量具有重要意義。目前，定量評價陰莖組織平滑肌含量必須采用有創的組織活檢技術，由于陰莖器官的特殊性，有創方法的臨床應用十分受限。

實時剪切波彈性成像 (shear wave elastrography,SWE)是一項無創的新型超聲定量檢查技術，該技術成像原理不同于常規灰階超聲 （brightness mode ultrasonography,B 型超聲），B 型超聲主要從形態學方面觀察病變，SWE 基本原理是利用探頭發射聲輻射力脈沖，進入組織導致組織粒子振動并產生橫向剪切波，成像系統可以精確檢測出感興趣區組織中橫向剪切波的速度（shear wave velocity,SWV）并進行實時成像和推算出被測組織的彈性量化測值（shear wave elastic quantitative measurement,SWQ）[2-4]。組織的細胞種類及含量可以直接影響SWV，從理論上講，SWQ 可以反映出被測組織細胞種類及含量的改變； 同時，初步研究發現，SWE 技術在陰莖疾病診斷方面具有價值[5-8]。據此，本研究試圖利用SWE 技術檢測平滑肌細胞含量不同的大鼠陰莖組織，探討SWQ 是否可以定量評價平滑肌含量的變化。

材料與方法

一、動物及試劑

（一）動物

20 只健康雄性SD 大鼠分成低年齡組（5-6 周齡，10 只）和高年齡組（52-60 周齡，10 只），20 只大鼠飼養環境完全相同。

（二）試劑

兔抗大鼠α-actin 抗體(ab82247,abcam)和山羊抗兔IgG H&L(HRP)抗體(ab6734,abcam)。

二、實驗方法

（一）SWE 檢查

1、SWE 成像

采用5%水合氯醛（劑量0.6 ml/100 g）進行腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后取仰臥位，固定四肢，充分暴露陰莖后開始進行SWE 成像，儀器采用AixplorerR新聲威超聲診斷儀 （SuperSonic Imagine,France），探頭為SL 15-4，取陰莖橫切面進行掃查，B 型超聲清晰顯示陰莖組織后啟動SWE，圖像優化選擇“Pen”，SWE 成像框應大于陰莖橫切面。分別選取陰莖近陰莖頭部、中部及近根部進行SWE 成像并實時存圖。

2、SWQ 測量

選取質量合格的SWE 圖像進行SWQ 測量，質量合格SWE 圖像的標準是： 感興趣區內色彩充填完整、呈油畫樣充填，無馬賽克樣彩色斑點。測量感興趣區（圓形）的劃定標準為以包膜為外界最大范圍地包繞陰莖，分別對陰莖頭部、中部及根部進行SWQ 測量，單位為kPa。

（二）陰莖平滑肌含量分析

1、取材

大鼠麻醉后，從陰莖根部用組織剪迅速剪斷，置入4%多聚甲醛固定液中，固定12～24 小時。

2、組織脫水

將陰莖從固定液中取出后擦干，依次置入70%、80%，90%、95%酒精中各2 小時，再置入100%酒精I和Ⅱ中各1 小時。

3、透明、包埋及切片

將脫完水的陰莖組織置入二甲苯中透明，透明時間根據組織的透明程度而定，大約是30 min。透明完畢后置入浸蠟，溫箱中過夜，次日進行包埋。修好蠟塊后，將陰莖組織按照陰莖頭部、中部及根部進行切片，切片厚度為5 μm，用涂抹了自制防脫液的載玻片撈取已展平的組織切片。

4、免疫組化染色

切片脫蠟至水，熱抗原修復10 min，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS）沖洗5min×3 次，擦干；滴 加3%H2O2，PBS 沖 洗5min×3 次，滴 加 封 閉 血 清15min，甩干；滴加兔抗大鼠α-actin 抗體(1：50)，室溫孵育4 h，PBS 沖洗5min×3 次；滴加山羊抗兔二抗15 min，PBS 沖洗5min×3 次，擦干； 滴加二氨基聯苯胺（diaminobenzidine, DAB）顯色，顯微鏡下控制顯色時間，蒸餾水沖洗中止顯色；蘇木素復染，脫水至二甲苯，樹膠封片。

5、圖像的采集和分析

免疫組化染色的圖像分析利用彩色圖文分析系統，由從事病理專業大于5年的醫師進行圖像分析及數據測量，分別測量陰莖頭部、中部及近根部組織切片中α-actin 陽性區域百分比 （positive area percentage,PAP）,PAP 代表平滑肌細胞的含量。

三、統計學方法

采用SPSS 22.0 分析軟件進行統計分析，數據均以均數±標準差表示。采用單樣本K-S 檢驗驗證兩組大鼠的SWQ、PAP 是否符合正態分布，利用Levene 方差齊性檢驗分析兩組大鼠的SWQ 和PAP 方差是否相等。如果數據符合正態分布且方差齊，則使用兩獨立樣本t檢驗分析兩組大鼠SWQ 之間的差異和PAP 之間的差異，如果樣本不符合正態分布或方差不齊，則使用Wilcoxon-Mann-Whitney 秩和檢驗。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

結 果

一、SWE 檢查

所有大鼠均成功完成陰莖組織的SWE 成像及SWQ 測量（圖1），灰階超聲圖像顯示陰莖橫切面呈圓形，邊界清晰，包膜完整，內部為均勻低回聲，SWE 圖像顯示陰莖組織內色彩充填完整、呈油畫樣，無馬賽克樣斑點。

低年齡組及高年齡組大鼠陰莖組織SWQ 均符合正態分布（P=0.200），但兩組方差不齊（P=0.011）。低年齡組大鼠陰莖組織SWQ 為（9.75±1.06）kPa，高年齡組大鼠陰莖組織SWQ 為（8.45±1.85）kPa，高年齡組大鼠陰莖組織SWQ 明顯低于低年齡組（P=0.001）。

圖1 大鼠陰莖SWE 圖像

二、平滑肌細胞含量

圖2 顯示兩組大鼠陰莖組織α-actin 的表達情況，低年齡組大鼠平滑肌稀疏，染色淺淡，高年齡組大鼠平滑肌則較為密集，著色較深。

低年齡組陰莖組織PAP 符合正態分布（P=0.200），高年齡組陰莖組織PAP 不符合正態分布（P=0.035），兩組方差不齊（P<0.001）。低年齡組大鼠陰莖組織PAP 為（3.56±0.92）%，高年齡組大鼠陰莖組織PAP 為（17.54±8.24）%，高年齡組大鼠陰莖組織PAP 明顯高于低年齡組（P<0.001）。

圖2 兩組大鼠陰莖組織α-actin 表達情況

討 論

陰莖海綿體主要有兩種細胞構成，即平滑肌細胞和成纖維細胞；其中平滑肌細胞約占40-52%[1]，是海綿體舒張的結構基礎，膠原纖維細胞構成海綿體的纖維支架結構，維持海綿體硬度，防止陰莖變形、彎曲[9]。迄今為止，國內外學者普遍認為，陰莖勃起的基本機制是：在性刺激下，平滑肌舒張，海綿體組織充血腫脹，海綿體內壓逐漸升高，同時白膜下靜脈受壓，回流血量逐漸減少，當海綿體內壓足夠大時，陰莖動脈血流流入停止，陰莖白膜下靜脈受壓而沒有血流流出，陰莖處于一個完全閉合的狀態，達到完全勃起。因此，平滑肌的含量直接影響勃起功能，準確評價陰莖組織內平滑肌細胞的含量至關重要。

目前，臨床準確評價陰莖組織平滑肌含量的唯一方法是活檢獲取陰莖組織樣本并通過免疫組化染色進行細胞定量，免疫組化染色進行陰莖組織平滑肌細胞含量的定量分析機制如下： 陰莖組織中平滑肌主要有海綿體平滑肌細胞和血管平滑肌細胞兩種類型，以海綿體平滑肌細胞為主，海綿體平滑肌細胞具有收縮功能，含有α-actin，α-actin 抗體可以作為定量海綿體平滑肌細胞的標記物。該方法取材操作時技術要求高，且為有創檢查，術后易造成陰莖疼痛、陰莖硬結等副作用，患者難以接受，實際臨床應用受到了極大限制，探索一種無創評價活體陰莖組織平滑肌細胞含量的方法具有重要的臨床意義。

目前，超聲影像是陰莖組織首選的臨床影像學檢查方法，但是，常規超聲檢查（灰階和多普勒）尚不能評價陰莖組織平滑肌細胞的含量。SWE 是一項無創的新型超聲定量檢查技術，該技術成像原理與常規B 型超聲不同：B 型超聲主要獲取和顯示病變的形態學信息和特征，SWE 基本原理是利用探頭發射聲輻射力脈沖，在組織不同深度上連續聚焦，被聚焦部位組織粒子高效振動并產生橫向剪切波，成像系統可以精確檢測出感興趣區組織中各個質點的橫向剪切波的速度（SWV）并進行實時成像和推算出感興趣區組織的彈性量化測值（SWQ）。由于感興趣區組織中細胞種類及含量直接影響SWV，因此從理論上講，SWQ 測值可以反映出被測組織的細胞種類及含量的改變。近幾年，國內外學者開展SWE 技術的相關研究，初步發現，SWE 技術在診斷陰莖硬結癥、勃起功能障礙方面具有獨特的價值[5-8]。據此，作者希望通過本研究證實：利用SWE 技術可以定量評價陰莖組織平滑肌含量的改變。

陰莖組織平滑肌的含量與年齡密切相關，正常生理條件下，不同年齡階段的陰莖組織平滑肌含量不同，故我們選取不同年齡組的大鼠進行研究。本研究選取α-actin 抗體進行陰莖組織的免疫組化染色分析，定量測定陰莖組織平滑肌含量，并以此作為“金標準”；同時,利用SWE 觀測大鼠陰莖組織的SWQ，結果顯示：低年齡組和高年齡組大鼠陰莖組織平滑肌含量存在顯著差異，兩組大鼠陰莖組織的SWQ 也存在顯著性差異。這一研究結果提示：SWQ 可以作為一項定量分析陰莖組織平滑肌含量的新指標，SWE 有望成為一種評價陰莖組織平滑肌含量的無創新方法，值得進一步研究。