2230對生殖異常夫婦男性染色體異常因素分析

邸建永 張美姿 劉 燁 劉 麗 徐鳳琴

天津市第一中心醫院 生殖醫學科（天津 300192）

生殖異常包括自然流產、胚胎停育、死胎、死產、生育畸形兒或智力低下兒等[1]，引起生殖異常的因素很多，其中遺傳因素占很大比重。有研究發現，在不育夫婦中男性染色體異常率顯著高于女性[2]，另外，Y 染色體長臂上的無精子因子（azoospermia facter，AZF）對精子的生成起著重要的作用，AZF 缺失也會引起男性生殖異常。我們回顧分析2013年12月到2019年2月到天津市第一中心醫院生殖醫學科就診的2230 對生育異常夫婦中男性核型分析結果和其中432 例少精子癥或無精子癥患者的Y 染色體微缺失的結果，探討男性異常核型和AZF 缺失與生殖異常的關系。

對象和方法

一、研究對象

2013年12月到2019年2月到天津市第一中心醫院生殖醫學科就診的2230 對夫婦中的男方，平均年齡（31.5±4.9）（20～63）歲，納入標準：少精子癥、無精子癥或夫婦曾經有過生育異常史（自然流產、胚胎停育、死胎、死產、生育畸形兒或智力低下兒），且女方染色體正常。

二、方法

（一）精液常規分析

采用手工操作進行檢測，按照《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊（第5 版）》的精液分析標準進行，精子濃度低于15×106/mL 的患者診斷為少精子癥，常規鏡檢無精子，對精液離心，鏡檢沉渣，連續3次均未發現精子者診斷為無精子癥。

（二）染色體檢查

經患者知情同意后，用5mL 注射器抽取靜脈血2mL 經肝素抗凝，30 滴接種于6mL 的培養基，37℃培養72 小時，常規染色體標本制備，G 顯帶。計數20 個分裂相，分析5 個細胞核型。異常核型則加倍計數分析。根據《人類細胞遺傳學國際命名體制》描述染色體異常核型。

（三）Y 染色體微缺失檢測

用上海透景提供的Y 染色體微缺失檢測試劑盒，采用兩管多重PCR 擴增，四個通道（FAM/VIC/ROX/Cy5）熒光檢測的方法，檢測AZF 三個區域六個序列標簽位點 （Sequence Tag Site） 包 括AZFa 區：SY84，SY86；AZFb 區：SY127，SY134；AZFc 區：SY254，SY255。設置兩個內對照基因： 男性性別決定基因（Sex-determining region of the Y chromosome，SRY）和編碼鋅指蛋白基因ZFX/ZFY（Zinc finger protein,X-linked,ZFX；Zinc finger protein, Y-linked, ZFY），設置陽性對照 （正常男性DNA）和陰性對照（超純水）。

檢測時，首先抽提血液標本DNA，然后以抽提標本為模板進行多重PCR 擴增，當存在靶標序列時，引物退火，并在Taq DNA 聚合酶作用下進行延伸，Taq 酶水解熒光探針，使得熒光探針上的熒光報告基團遠離淬滅基團而發出熒光信號，游離的報告基團數目與對應PCR 擴增產物正相關。分析系統可以自動監測熒光信號，判斷。

結 果

2230 例男性核型分析結果異常核型75 例，異常檢出率3.36%（75/2230），其中結構異常包括相互易位19例，羅氏易位11 例，倒位19 例，占異常的65.33%(49/75)，性染色體異常26 例，占異常的34.67%（26/75）。

432 例少精子癥或無精子癥男性檢測出32 例Y 染色體存在AZF 區域的缺失，檢出率7.41%（32/432），其中AZFc 區域缺失20 例占比最高為62.5%（20/32），AZFb+c區域缺失7 例占比為21.88%（7/32），AZFa 區域缺失1 例，AZFb 區域缺失2 例，分別占比3.13%（1/32） 和6.25%（2/32），AZFa+b+c 區域缺失2 例占比6.25%（2/32），這2例患者核型均為46，XX，其中1 例SRY 缺失。

討 論

一、異常核型對生育異常的影響

染色體異常是引起生殖異常的主要原因，導致反復流產、死胎、死產、生育畸形兒[3,4]。Ravel C 在10202 名供精生育力正常的男性中檢出異常核型率僅為0.37%[5]，而本研究中生育異常的男性異常核型檢出率為3.36%，高于正常人群。

本研究中結構異常共35 例，全部為常染色體異常，包括羅氏易位、相互易位、倒位。羅氏易位和相互易位也稱平衡易位，平衡易位男性攜帶者可以表現為從正常到少精甚至無精子的多種臨床表現[6]，對于少精子或無精子的相互易位攜帶者可能是斷裂點涉及到精子生成的基因，斷點的出現使相關的基因在精子發生的過程中表達改變，導致精子發生障礙[7]。本研究中核型為46,XY,t(1;8)(p22;p21) 的男性表現為無精子癥，R.X.Wang 研究發現1 號染色體的p22 斷點與男性不育有顯著的相關性，多名攜帶者表現為無精子和嚴重少精子[8]。本研究中出現羅氏易位11 例，常見的為45,XY,rob (13;14)(q10;q10)和45,XY,rob(14;21)(q10;q10)，羅 氏 易 位 引 起 的 少精子癥或無精子癥，有研究認為是由于減數分裂時檢驗點的干預，兩次檢驗點的干預導致無精子癥，第一次檢驗點干預導致少精子癥[9,10]。本研究出現了1 例同源染色體易位46,XY,rob（21;21），該攜帶者在精子生成的過程中，會出現易位型的21 號染色體不分離，受精形成的胚胎會形成三體或單體，生育正常核型的后代的幾率很低。本研究出現14 例僅inv(9)核型和2 例易位并inv(9)核型，臨床表現為不孕，自然流產和胎停育等。有研究者以行輔助生殖技術夫婦為研究對象，發現inv（9）的攜帶者行輔助生殖技術的結果與對照組無統計學顯著差異，女性攜帶者組和男性攜帶者組有統計學上相似的結果，但女性攜帶者的預后可能比男性攜帶者好[11]。但也有文獻報道認為inv（9）與生殖異常相關[12]。

表1 異常核型及臨床表現

表2 Y 染色體AZF 缺失及臨床表現

本研究中性染色體異常核型包括47,XXY、47,XYY、45,X/46,XY、46,XX 等。核 型47,XXY 又 稱 為Klinefelter 綜合征，男性中發病率2/1000，是導致男性不育最常見的一種類型，本研究中18 例47，XXY，1 例47,XXY/46,XY，發生率0.85%(19/2230)。Klinefelter 綜合征至少會多出一條X 染色體，減數分裂或有絲分裂時，性染色體不分離均可導致患者性染色體的異常。兩種核型形式存在，90%為47,XXY,10%為47,XXY/46,XY，或多出更多X 染色體，典型Klinefelter 綜合征癥狀包括：（1） 男子乳房發育和睪酮缺乏引起的性欲低下；（2）小睪丸和支持細胞功能障礙引起的不育；（3）專注力和學習能力的降低[13]。Klinefelter 患者從青春期開始逐漸失去精原干細胞，成年Klinefelter 綜合征患者的睪丸內的曲細精管表現纖維化和透明化，絕大部分Klinefelter 患者表現為無精子癥，但通過顯微取精可以在40%的患者睪丸內發現精子，在通過ICSI 獲得自己的后代[14]。核型為45,X/46,XY 的患者2 例，45,X/46,XY患者在新生兒的發病率1.5/10000，具體形成機制尚未明確，可能與細胞有絲分裂過程中Y 染色體不能順利分離進入兩個子代細胞相關。45,X/46,XY 嵌合體臨床表現多樣化，包括表現為女性表型、兩性畸形和正常男性表型等[15]。表型為男性的患者絕大部分表現為無精子癥而無生育能力，可能與高比率的AZF 基因缺失密切相關[16]，本研究中2 例患者表現無精子癥，進行了Y 染色體微缺失的檢測，沒有AZF 位點的缺失，對于45,X/46,XY 嵌合體男性表現為無精子癥的機制需要進一步研究。46,XX 核型患者2 例，為46,XX 男性性反轉臨床表現無精子癥，陰毛呈女性分布，促性腺激素水平升高，睪酮水平低。PCR 檢測結果（見表2），1 例存在SRY基因，1 例SRY 基因缺失。46,XX 男性性反轉的發病機制還不十分明確，對于存在SRY 基因的，認為SRY 基因易位到X 染色體的短臂或常染色體上，對于不存在SRY 基因的有以下假設：（1）SRY 基因位于嵌合的性腺上；（2）46,XX 核型抑制其向男性發育的基因發生突變；（3）SRY 基因下游的性別決定基因發生改變[17]。

二、Y 染色體微缺失和生殖異常

AZF 區域位于Y 染色體的長臂上，這個區域包含精子發生相關的基因。Y 染色體AZF 區域缺失是僅次于Klinefelter 綜合征導致男性不育的第二大已知遺傳原因[18]，本研究中432 例無精子或少精子患者，共有32 例患者存在不同形式的缺失，檢出率7.4%，在以往的研究報道中AZF 缺失在無精子癥和少弱精子癥患者中發生率為3.3%～11.75%[19,20]，AZF 分為AZFa、AZFb、AZFc 三個相互獨立的區域[21]，對應5 種形式的缺失AZFa、AZFb、AZFc、AZFb+c、AZFa+b+c，不同形式缺失會導致不同的臨床表現，且不同形式發生的頻率不同，與以往研究一致[20]，本研究中AZFc 區域缺失發生的頻率最高，占比為62.5%，AZFc 區域缺失患者的精液表現是多樣化的，可以表現為正常、 少精子癥或無精子癥[22]，本研究中20 例AZFc，其中10 個無精子癥，8 個重度少精子癥，2 個少精子癥。AZFa 缺失在AZF 區域缺失出現頻率較低，本研究中僅出現1 例，占比3.13%，AZFa 缺失表現出唯支持細胞綜合征和無精子癥[22]，AZFb 或AZFb+c 缺失可表現出唯支持細胞綜合征和生精阻滯[23]，本研究中兩種缺失比例分別6.25%和21.88%，均表現為無精子癥。5 種形式的AZF 區域缺失類型中，AZFc 缺失的男性可以自然受孕擁有自己的后代，但后代有可能是不育的[24]，AZFc 區缺失的嚴重少精子或無精子癥患者，可以通過睪丸顯微取精手術和人工輔助生殖技術獲得自己的后代，助孕時建議行性別選擇，以避免遺傳缺陷的垂直傳播。

綜上所述，男性染色體異常因素對夫婦生殖異常影響不容忽視，檢測男性染色體，對于查找生育異常的病因，指導生育和阻止有害遺傳因素傳遞給下一代有積極的意義。