基于整合藥理學探究中藥方劑治療勃起功能障礙核心藥物的作用機制*

孫占東 劉 嘉 曾明月 曾慶琪,3

1. 江蘇衛生健康職業學院（江蘇南京 211800）；2. 北京中醫藥大學（北京 100029）；3. 南京中醫藥大學第一附屬醫院（江蘇南京 210029）

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED），中醫稱之為陽痿，是臨床男科常見的性功能障礙疾病之一[1]。中醫學認為陰莖不能勃起,或勃而不堅，或堅而不久,皆屬于該病的臨床表現[2]。中醫藥對其防治具有悠久的歷史，有著較為完整的理論架構和特有的治療手段[3]。《中華人民共和國衛生部藥品標準——中藥成方制劑》(簡稱《中藥成方制劑》)[4]中收錄不少于百種的中藥方劑，但目前的科學研究中，對于中藥治療勃起功能障礙的組方用藥規律，組方核心藥物的挖掘，藥物的成分、靶標，分子內在的作用機制等相關研究較少，未能較好的在微觀層面闡明中醫藥治療疾病的機理機制。

整合藥理學是中藥現代研究新模式,藥理學研究的新領域。由中國中醫科學院中藥研究所開發的“中醫藥整合藥理學研究平臺v2.0（Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine v2.0,TCMIP V2.0）”，包含了中藥材、中藥方劑、中藥成分、中藥靶標、 疾病相關分子等五大數據庫資源[5]，可用于揭示中醫藥理論的科學內涵、挖掘組方用藥經驗、闡釋中藥作用原理、分析中藥藥理效應等研究，為中醫藥的現代化研究提供強有力的數據支撐和分析平臺。本研究基于TCMIPv2.0 平臺，分析中醫藥治療勃起功能障礙方劑的核心用藥，闡釋藥物的藥效物質基礎（主要成分、靶點）及作用機制，為臨床及科研的深入開展提供一定的理論依據。

資料與方法

一、方劑收集錄入

中醫藥整合藥理學研究平臺（http：//www.tcmip.cn/）中藥方劑數據庫中收錄了《中藥成方制劑》記載的方劑數據，包括方劑名稱、藥物組成、功效疾病、主治證候等信息。利用該平臺，按指定疾病“陽痿”提取數據庫中的方劑信息。

二、核心藥物數據挖掘

中藥治療勃起功能障礙的核心藥物由“高頻次單味藥材（藥物在所有方劑中出現次數大于20%）”與“高頻次藥組（藥組在所有方劑中出現次數大于20%）”的交集組成。通過中醫藥整合藥理學研究平臺“組方用藥規律分析”模塊，對獲取到的方劑進行數據分析，包括處方中所含藥物頻次統計、組方規律。高頻次單味藥材的獲取，應用“組方中藥的頻次統計”選項，可一鍵化獲得各味中藥的用藥頻次，選取用藥次數大于總方劑數×20%的藥物；高頻次藥組的獲取，應用“組方中藥的關聯性分析”選項，該功能基于關聯規則算法，分別設置“2味、3 味、4 味”藥組，計算相應藥組頻次，選擇頻率大于20%的藥組作為數據結果。

三、中藥化學成分來源

在中醫藥整合藥理學研究平臺-中藥材數據庫，對核心藥組藥物進行檢索，收集所有化學成分，建立中藥治療“勃起功能障礙”核心藥組化學成分數據庫。

四、中藥靶標預測及GO 富集分析

利用中醫藥整合藥理學研究平臺中的“中藥（含方劑）靶標預測及功能分析”模塊，依次輸入核心藥組藥物名稱，即可對核心藥組的藥物進行靶標預測及GO富集分析。該模塊針對中藥化學成分和FDA 上市藥物進行相似性打分，獲取高可信度（Similar Score>0.8）的中藥候選靶標譜，可進一步闡釋中藥作用機理。

五、疾病相關基因集獲取

TCMIP V2.0 平臺整合了疾病 “基因相關性數據庫”（DisGeNET）、“人 類 表 型 本 體 數 據 庫”（HPO）、“Drugbank 數據庫”、“治療靶標數據庫”（TTD）等資源，構建起疾病和常見臨床表型相關基因數據庫。在TCMIP V2.0 平臺疾病相關分子集及其功能挖掘模塊，以“erectile dysfunction”作為關鍵詞，通過檢索可獲取勃起功能障礙疾病的相關基因。

六、 中藥- 疾病核心靶標蛋白質相互作用網絡及生物通路分析

通過整合藥理學平臺的“中醫藥關聯網絡挖掘”模塊，該 模 塊 鑲 嵌 了HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT、DIP、PDZBase 等包含蛋白質- 蛋白質相互作用數據的數據庫，可構建中藥與勃起功能障礙核心靶標的蛋白互作網絡(protein protein interaction network,PPI network)。應用Cytoscape 3.4 軟件繪制網絡圖。同時，該模塊整合了Reactome（https://reactome.org/）[6]生物通路數據庫，可對獲得網絡中包含的所有基因參與的生物通路進行分析。

結 果

一、中藥治療勃起功能障礙核心藥物結果

應用平臺中的中藥方劑數據庫，共計獲得治療勃起功能障礙方劑127 首，包含280 味中藥材。對各味中藥在方劑中出現的頻率進行統計，提取頻率大于20%的藥材從高到低進行列出。分別為枸杞子（72 首，57.6%）、菟絲子（62 首，49.6%）、熟地黃（61 首，48.8%）、淫羊藿（60首，48%）、肉蓯蓉（47 首，37.6%）、當歸（43 首，34.4%）、人 參（42 首，33.6%）、山 藥（38 首，30.4%）、補 骨 脂（37首，29.6%）、茯苓（36 首，28.8%）、五味子（36 首，28.8%）、杜仲（35 首，28%）、巴戟天（34 首，27.2%）、黃芪（28 首，22.4%）、牛膝（26 首，20.8%）。藥物組合頻率大于20%的藥組，分析結果如表1 所示。綜合高頻次單味藥與高頻次藥組結果，確定中藥治療勃起功能障礙的核心藥物為枸杞子、熟地黃、肉蓯蓉、菟絲子、山藥、淫羊藿、杜仲、茯苓、當歸、巴戟天、人參、補骨脂、五味子。

表1 治療勃起功能障礙方劑藥物組合頻率大于20%藥組

二、核心藥物化學成分

基于TCMIP V2.0中的中藥材數據庫，依次分析核心藥物的化學成分。枸杞子收集到化學成分57 個，主要為多糖、氨基酸、生物堿、揮發油等；熟地黃收集到化學成分12 個、主要為糖類、谷甾醇、核苷等；肉蓯蓉收集到50 個化合成分，主要為肉蓯蓉苷、生物堿、氨基酸等；菟絲子收集到化學成分8 個，主要為糖苷、胡蘿卜素、山奈酚等；山藥收集到45 個化合成分，主要為甘露糖、多巴胺、氨基酸等；淫羊藿收集到化學成分27 個，主要為黃酮類化合物、淫羊藿苷、棕櫚酸等；杜仲收集到化學成分52 個，主要為黃酮類、環烯醚萜、甾體和萜類等；茯苓收集到33 個化學成分，主要為多糖、脂肪酸、甾醇類等；當歸收集到65 個化學成分，主要為揮發油、酚酸類、黃酮類等；巴戟天收集到19 個化學成分，主要為糖類、谷甾醇、胡蘿卜苷等；人參收集到158 個化學成分，主要為皂苷類、多糖類、有機酸等；補骨脂收集到32 個化學成分，主要為香豆素類、黃酮類、單萜酚類等；五味子收集到99 個化學成分，主要為木脂素類、有機酸、揮發性油等。

三、中藥靶標預測及GO 富集分析結果

中藥化學成分復雜，且已知作用靶點有限，通過獲得更多且可靠性高的靶標是研究中藥作用原理的關鍵問題[7]。基于Tcmip V2.0 中的中藥（含方劑）靶標預測及功能分析模塊可以獲得每味核心藥物的靶標，并且對預測出的靶標進行GO 功能富集分析。枸杞子獲得靶標基因235 個、熟地黃獲得靶標基因656 個、肉蓯蓉獲得靶標基因326 個、菟絲子獲得靶標基因101 個、山藥獲得靶標基因898 個、淫羊藿獲得靶標基因200 個、杜仲獲得靶標基因338 個、茯苓獲得靶標基因232 個、當歸獲得靶標基因334 個、巴戟天獲得靶標基因235 個、人參獲得靶標基因1283 個、 補骨脂獲得靶標基因255個、五味子獲得靶標基因94 個。對各個藥物的靶標基因取交集，13 位中藥共同作用的靶標基因為AR （雄激素受體） 基因。對核心藥物靶點基因進行GO 富集分析，結果如表2 所示。

表2 核心藥物靶點基因GO 富集分析結果

四、疾病相關基因集獲取結果

基于TCMIP V2.0平臺疾病相關分子集及其功能挖掘模塊，輸入疾病關鍵詞后，共獲得勃起功能障礙疾病基因17 個，見表3。

表3 勃起功能障礙疾病相關基因

五、中藥-疾病蛋白質相互作用網絡及生物通路分析結果

應用TCMIP V2.0平臺中的中醫藥關聯網絡挖掘模塊，可構建中藥靶標與疾病靶標蛋白質互作網絡，并可對網絡中的基因進行深入的生物通路分析。基于平臺中的蛋白數據庫，核心藥物與勃起功能障礙疾病構建的核心靶標網絡中包含108 個基因，其中中藥基因101 個，疾病基因10 個，共同基因3 個。蛋白互作網絡如圖1 所示。對核心靶標蛋白互作網絡進行生物通路分析，顯著富集的前20 條通路結果如圖2 所示。

圖1 中藥與疾病核心靶標蛋白互作網絡圖

圖2 中藥與疾病核心靶標生物通路富集分析結果（●為前20 條生物通路）

討 論

由于中醫藥治療勃起功能障礙的方劑較多，配伍較為靈活，靶點眾多，對其治療疾病的作用機制一直是科學研究的重、難點[8]。本研究采用挖掘組方規律與整合藥理學的方法，對《中藥成方制劑》中治療男科勃起功能障礙疾病的方劑進行收集，挖掘方劑核心藥物的作用機制和藥效物質基礎，并進行了深入的藥理學分析，為中藥方劑治療疾病的機理機制研究提供了新思路。

通過對《中藥成方制劑》中勃起功能障礙方劑的組方規律分析，從127 味中藥中挖掘出13 味核心藥物。其中居于前三位的單味藥為枸杞子、菟絲子、熟地黃；前三位藥對為枸杞子—菟絲子、枸杞子—熟地黃、熟地黃—菟絲子，與方劑“右歸丸”中部分藥物相吻合。“右歸丸”是治療陽痿遺精、腎陽不足的經典名方[9]。結合該三味藥物的特性可知，中醫對于勃起功能障礙的治療首選溫補腎陽、益氣養血之品[10]。對13 味藥物進行四氣五味歸經分析，發現四氣中溫性藥占主體，有9 味藥屬溫性（肉蓯蓉、淫羊藿、杜仲、當歸、巴戟天、熟地黃、人參、補骨脂、五味子），其余4 味皆屬平性（枸杞子、菟絲子、山藥、茯苓）；五味中甘味占多數，只有淫羊藿屬苦味、補骨脂屬辛味，其余藥材或屬純甘味，或屬甘、苦，甘、咸，甘、辛味。歸經分析發現，除當歸屬心經、肝經、脾經，其余12 味藥物皆含腎經，并與肝經、脾經、肺經、心經、 大腸經密切相關，說明藥物的作用以腎經為根本，協同體內其他臟器共同作用，產生滋腎壯陽、補血養陰、精氣充髓、活血通絡等功效，針對勃起功能障礙疾病表現出的腎虛肝郁、氣滯血瘀、濕熱下注、陰虛火旺等證，發揮特定的治療作用。

對于核心藥物化學成分的分析，再次證明了中藥具有多成分，且不同中藥具有相同成分的特性[11]。在用藥過程中，藥物的作用是復雜的多對多關系。以淫羊藿為例，該藥物以黃酮類化合物為主要成分，能夠影響下丘腦—垂體—性腺軸、腎上腺皮質軸等內分泌系統，其提取液能已被證明能夠通過血睪屏障,在生殖系統中發揮作用[12]。在當歸、補骨脂、杜仲等中藥中也具有黃酮類成分。從而可知，核心藥物中所含的某些化學成分與勃起功能障礙疾病密切相關，為中醫臨床藥物的選擇提供了科學依據。進一步對藥物化學成分的作用靶標進行分析，發現每位中藥的靶標數各不相同，但由于不同中藥之間具有相同的化學成分，以致不同藥物具有部分相同的靶標，說明在基因作用層面，藥物仍存在協同作用的關系[13]，藥物的協同作用有效增強了藥效，對于疾病的治療起著積極促進的作用。13 味核心藥物唯一共同作用的靶標為AR（androgen receptor，雄激素受體）基因，該基因與體內雄激素的形成密切相關，是雄激素作用的中介物質，能夠使細胞的功能發生改變，具有促進細胞分化和組織器官的發育等功能[14]。以此可推斷，13 味核心藥物對于勃起功能障礙疾病的治療，可能與調控體內某些關鍵基因（如AR 基因）密切相關。通過對核心藥物全部靶點基因的GO 富集分析，發現藥物主要參與氧化還原過程、藥物反應脂質代謝過程、類固醇代謝過程、 類固醇激素介導的信號通路等一系列生物過程，在線粒體、神經元、髓鞘、突觸后膜等細胞位置，起到氧化還原酶的激活、藥物綁定、催化活性、核苷酸綁定、核受體的活動等分子作用。

通過對中藥與疾病核心靶點蛋白相互作網絡的構建，可清晰的看出藥物作用靶標與疾病作用靶點之間的復雜網絡關系。在已知的藥物基因與勃起功能障礙基因之間，存在多對多的作用，既有共同相互作用的基因，也有獨立調控的基因。通過進一步的網絡功能分析，發現蛋白作用網絡主要通過復合生物合成、protein kinase A（PKA）激活、腺苷酸環化酶激活途徑、Tumor Protein p53 （TP53)調節代謝、 胰高血糖素信號轉導中PKA 的激活、 胰高血糖素信號在代謝調節中的作用、Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2（VEGFR2）介導的血管通透等生物過程，在體內產生治療勃起功能障礙疾病的作用。藥物與疾病的作用在微觀層面是復雜的，涉及多過程、多成分、多反應，對于藥物治療勃起功能障礙的核心作用過程，仍需開展深入的實驗驗證。

綜上，本研究利用整合藥理學方法從藥材—成分—靶標—通路—疾病等不同層面，深入開展了中藥方劑治療勃起功能障礙方劑核心藥物的作用機制研究，較為清晰的闡明了中藥藥物在治療勃起功能障礙疾病過程中發揮的中藥作用。同時，本研究也為中藥方劑治療男科疾病的作用機制研究提供新思路與方法，進而推進中醫藥治療男科疾病的現代化。