異甘草素通過Smad3/Arid2-IR/NF-κB軸改善順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠炎癥反應(yīng)

文 丹廖 媛李健春張宇韋樊均明

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科,四川瀘州 646000;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心,四川 瀘州 646000;3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院腎病內(nèi)科,四川 瀘州 646000;4.成都醫(yī)學(xué)院,成都 610000)

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是由多種因素導(dǎo)致的腎功能短時(shí)間內(nèi)急劇降低的臨床綜合征,是一種發(fā)病率及死亡率均較高的臨床危重疾病。在臨床實(shí)踐中,順鉑被廣泛應(yīng)用于各類癌癥的化療[1],這是導(dǎo)致AKI的重要因素,有研究指出約1/3患者在接受順鉑化療后發(fā)生AKI[2],嚴(yán)重的不良反應(yīng)大大限制了其臨床使用。順鉑所致AKI的特征性病理改變是腎小管-間質(zhì)急性損傷、炎癥反應(yīng)[3],反復(fù)注射也可導(dǎo)致慢性腎功能不全[4]。核因子-kB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)促腎炎癥和纖維化[5]的靶分子,受藥理學(xué)試劑等病理性因素激活時(shí)可促進(jìn)下游各種炎細(xì)胞因子的表達(dá),進(jìn)而介導(dǎo)白細(xì)胞的趨化和黏附,導(dǎo)致腎急性充血水腫、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),對(duì)腎組織形成不可逆損害[6-7]。目前尚無可用于減輕AKI發(fā)生時(shí)炎癥水平、保持器官功能、提升患者存活率的特效治療藥物,而通過抑制NF-κB通路可能是一種減輕AKI所致腎炎癥、維護(hù)免疫系統(tǒng)功能的方法。

越來越多的證據(jù)表明,長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs,LncRNAs)在腎疾病中起著關(guān)鍵作用[8-9],Smad3在TGF-β1介導(dǎo)腎炎癥和纖維化過程中是一個(gè)關(guān)鍵的中介[10],最近有研究發(fā)現(xiàn)LncRNA Arid2-IR的啟動(dòng)子區(qū)域存在與Smad3相結(jié)合位點(diǎn),在腎炎性病變時(shí)可檢測(cè)到Arid2-IR表達(dá)增加,而過表達(dá)Arid2-IR可調(diào)控后續(xù)NF-κB分子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)[11],據(jù)此推斷Arid2-IR是一種新型促Smad3/NF-κB依賴的與腎炎癥相關(guān)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA,通過下調(diào)Arid2-IR的表達(dá)進(jìn)而抑制Smad3/NF-κB信號(hào)通路活性可能是治療AKI腎炎癥的一種新方法。異甘草素(isoliquiritigenin,ISO)在近代研究中發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)良的抗腫瘤、抗氧化以及抗炎作用[12],在肝和肺部炎癥中都可以減輕炎癥反應(yīng)對(duì)組織的損害[13-14],但目前關(guān)于其在AKI動(dòng)物模型中的作用報(bào)道甚少。本研究擬通過觀察異甘草素對(duì)順鉑誘導(dǎo)AKI小鼠腎的抗炎作用,并通過檢測(cè)異甘草素對(duì)Arid2-IR/Smad3/NF-κB信號(hào)軸的影響,探討其作用機(jī)制,為開發(fā)異甘草素在防治AKI相關(guān)疾病方面的藥物價(jià)值奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康的SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠30只,體重18～22 g,8周齡,購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(川)2015-030],本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的無菌手術(shù)全程于西南醫(yī)科大學(xué)SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成[SYXK(川)2018-065]。小鼠籠置于安靜環(huán)境,室溫23℃ ～26℃,相對(duì)濕度 45%～55%,明暗交替12 h,全實(shí)驗(yàn)過程予以普通飼料和自由飲水,正式實(shí)驗(yàn)前予以適應(yīng)新喂養(yǎng)一周,實(shí)驗(yàn)過程中的所有操作符合西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和要求(2017DW027),實(shí)驗(yàn)過程中已遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

順鉑溶液(國(guó)藥準(zhǔn)字20040803,批號(hào)19030,江蘇豪森公司);異甘草素(純度：HPLC＞95%)(批號(hào)PRF9082923,四川普瑞法公司);總RNA提取試劑盒(批號(hào)Q5111,北京天根生化科技);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Go Script TM reverse Transcription System(批號(hào)A5001,美國(guó) Promega公司);NF-κB兔單抗(批號(hào)AD120519,北京博奧森公司);Smad3兔單抗(貨號(hào)9513S)、p-Smad3 兔單抗(貨號(hào) 9520S)、p-NF-κB 兔單抗(貨號(hào)3033)購于美國(guó)CST公司;IL-6鼠單抗(貨號(hào) ab9324,Abcam公司);IL-1β鼠單抗(貨號(hào)sC-52012,Santa Cruz公司);ECL凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司);酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek公司);Light CyclerR480II PCR儀(瑞士Roche公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

30只體重18～22 g的SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為NC組、AKI組、ISO-L組、ISO-H組和Irb組。除NC組外,其余各組均接受腹腔單次注射順鉑20 mg/kg,NC組腹腔注射等量生理鹽水。順鉑注射后24 h后,ISO-L和ISO-H組分別灌胃異甘草素溶液7.5 mg/kg、30 mg/kg 3 d,Irb組灌胃厄貝沙坦溶液20 mg/kg 3 d,NC組和AKI組以等量生理鹽水灌胃3 d。灌胃3 d后處死小鼠,取血置于4℃過夜;剖取右腎,剝?nèi)グげ⒂肞BS沖凈血污,于4%多聚甲醛固定24 h,乙醇梯度脫水、石蠟包埋保存;左腎組織即可存儲(chǔ)于-80℃冰箱。

1.3.2 血清肌酐、血尿素氮檢測(cè)

采集血于4℃靜置過夜后,于3500 r/min離心10 min后吸取上層血清,按照說明書操作檢測(cè)血清肌酐、尿素氮檢測(cè)。

1.3.3 腎形態(tài)學(xué)檢查

采用HE、PAS等常規(guī)病理染色觀察腎的病理變化：切片于65℃條件下烤2 h后,二甲苯脫蠟,經(jīng)乙醇復(fù)水。HE、PAS染色嚴(yán)格按照說明書步驟操作。于光鏡下通過HE染色觀察腎結(jié)構(gòu)病理改變,PAS染色觀察腎組織的損傷產(chǎn)物沉積程度。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎中炎癥指標(biāo)IL-6、IL-1β的表達(dá)：切片經(jīng)上述常規(guī)處理后,滴加過氧化氫阻斷劑10 min,5%BSA封閉15 min,滴加一抗(1∶150),4℃過夜,加二抗后常溫孵育1 h,以DAB顯色劑顯色,拍照后使用Image J軟件對(duì)切片中陽性區(qū)域進(jìn)行量化。

1.3.5 Western blot法測(cè)定蛋白水平

切取各組左腎皮質(zhì)30 mg于500μL IP蛋白裂解液和10×PMSF混合液中,在冰上研磨,經(jīng)機(jī)械勻漿后,冰上搖晃裂解30 min,提取總蛋白,考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度,加5×Loading Buffer后于100℃煮10 min后上樣,經(jīng)SDS-PAGE膠電泳分離,于恒壓100 V轉(zhuǎn)膜,5%BSA室溫封閉1 h,加一抗IL-1β(1∶1 000)、IL-6(1 ∶1 000)、p-Smad3(1 ∶1 000)、Smad3(1∶1 000)、p-NF-κB(1 ∶1 000)、NF-κB(1 ∶1 000)、GAPDH(1：50 000)于4℃搖床過夜,后加HRP標(biāo)記二抗(1∶3 000)于室溫孵育1 h,滴加ECL發(fā)光液于Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)成像。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的IOD值的比值作為其蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6 炎癥因子和Arid2-IR的基因檢測(cè)

取各組左腎皮質(zhì)25 mg,用滅菌處理的眼科剪在提前預(yù)冷的裂解液RZ中剪碎至無肉眼可見顆粒,按照RNA simple Total RNA Kit試劑盒說明書操作從腎中提取腎組織總 RNA,最后加入 30μL Nuclease-Free Water 混 勻, Thermo Fisher NANODROP 2000分光分度計(jì)上測(cè)RNA濃度。制備逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,按照 Go ScriptTMreverse Transcription System試劑盒推薦比例配置：4μL 5×Reaction Buffer,1 μL PCR Nucleotide Mix(核苷酸混合物),1μL Go ScriptTMReverse Transcriptase(逆轉(zhuǎn)錄酶),1μL MgCl2(終濃度2.5 mmol/L,逆轉(zhuǎn)錄酶活性增強(qiáng)劑),8μL Nuclease-Free Water,吹打混勻。將5μL cDNA加入逆轉(zhuǎn)錄體系,混勻并離心后逆轉(zhuǎn)錄程序如下：25℃ 5 min,4℃ 1 h,70℃ 15 min;逆轉(zhuǎn)錄完畢加入80μL Nuclease-Free Water,-20℃保存?zhèn)溆谩Ｔ?LightCycler? 480 II上機(jī)檢測(cè) Arid2-IR、IL-1β和IL-6的表達(dá)量,上機(jī)結(jié)果分析采用2-ΔΔCt進(jìn)行分析,引物序列如表1,檢測(cè)到的基因相對(duì)水平以GAPDH正常化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0對(duì)計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間兩兩比較用t檢驗(yàn),多組間用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn),當(dāng)P＜0.05示為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Real-time PCR所用引物序列Table 1 The primer sequences of Real-time

2 結(jié)果

2.1 異甘草素對(duì)AKI小鼠一般情況的影響

各組小鼠均無死亡現(xiàn)象,AKI組小鼠體重較NC組活動(dòng)減弱;相比AKI組,異甘草素及Irb干預(yù)可以明顯改善小鼠活動(dòng)度。

2.2 異甘草素對(duì)AKI小鼠肌酐、尿素氮的影響

與NC組相比,AKI組的血清肌酐和尿素氮明顯增加;與AKI組相比,異甘草素干預(yù)可使血清肌酐和尿素氮均有下降(P＜0.05),且ISO-H組的血清肌酐和尿素氮低于Irb組,見圖1A、1B。

2.3 異甘草素對(duì)AKI小鼠腎組織結(jié)構(gòu)改變

HE染色可見,AKI組小鼠腎腎小管上皮細(xì)胞大量萎縮壞死,致小管間出現(xiàn)明顯間隙,腎結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重;異甘草素干預(yù)可明顯減少腎組織中腎小管上皮細(xì)胞的壞死,減小腎小管間病理性間隙,使腎結(jié)構(gòu)恢復(fù)良好。PAS染色可見AKI組小鼠腎有明顯紫紅色糖原相關(guān)復(fù)合物的沉積,異甘草素干預(yù)可明顯減少沉積物,見圖1C。

2.4 異甘草素對(duì)AKI小鼠炎癥指標(biāo)的影響

與NC組相比,AKI組小鼠腎中 IL-6、IL-1β在基因與蛋白水平的表達(dá)均出現(xiàn)明顯升高;與AKI組相比,異甘草素和厄貝沙坦干預(yù)均可顯著下調(diào)IL-6、IL-1β在基因和蛋白水平的表達(dá),見圖2。

2.5 異甘草素對(duì) AKI小鼠 Arid2-IR表達(dá)和Smad3、NF-κB 活性的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示,與NC組相比,AKI組腎組織Arid2-IR在基因水平表達(dá)顯著升高,在異甘草素干預(yù)之后其表達(dá)均明顯下調(diào)。Western blot結(jié)果提示,與NC組相比,AKI組腎組織中p-Smad3和p-NF-κB表達(dá)明顯增加,在異甘草素干預(yù)以后,p-Smad3和p-NF-κB表達(dá)明顯減少,表明異甘草素干預(yù)可以抑制AKI小鼠腎中Smad3/NF-κB信號(hào)通路的活性,見圖3。

3 討論

AKI病理變化過程中所涉及的機(jī)制包括氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡等[15],其中炎癥是一個(gè)消除病原體和介導(dǎo)受損組織修復(fù)的復(fù)雜過程,炎癥水平過高可引起免疫系統(tǒng)紊亂、纖維化和組織損傷,其相關(guān)的機(jī)制涉及細(xì)胞因子的釋放、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的聚集、損傷相關(guān)分子的釋放[16]。本研究在順鉑誘導(dǎo)AKI小鼠模型上探討異甘草素對(duì)AKI小鼠腎的保護(hù)作用及機(jī)制研究。研究結(jié)果顯示,AKI造模后,腎病理結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷,腎中炎癥因子的表達(dá)均顯著上調(diào);異甘草素干預(yù)后,受損的腎生理結(jié)構(gòu)部分得到恢復(fù),且炎癥因子的表達(dá)顯著下降,提示異甘草素具有較好的抗炎、改善腎結(jié)構(gòu)的效果。

圖1 異甘草素對(duì)順鉑誘導(dǎo)AKI小鼠腎病理結(jié)構(gòu)的影響(HE、PAS)Note.A、B,SCr and BUN results of mice.C,HE and PASstaining results.Compared with control group,***P＜ 0.001,****P＜ 0.0001.Compared with AKI group,##P＜ 0.01,###P＜ 0.001,####P＜0.0001.Figure 1 Effect of isoliquiritigenin on renal morphology in AKI kidneys induced by cisplatin

圖2 異甘草素對(duì)順鉑誘導(dǎo)AKI小鼠腎炎癥水平的影響(IHC)Notes.A、B,Real-time PCR results of IL-1β and IL-6.C、D,Western blot result of IL-6 and IL-1β.E、F,IHCresults of IL-6 and IL-1β.Compared with control group,*P＜0.01,**P＜0.05.Compared with AKI group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001.Figure 2 Effect of isoliquiritigenin on renal inflammatory markers in AKI kidneys induced by cisplatin

圖3 異甘草素對(duì)順鉑誘導(dǎo)AKI小鼠腎Smad3/Arid2-IR/NF-κB軸水平的影響Notes.A,Real-time PCR results of Arid2-IR.B-D,Western blot results of p-Smad3,Smad3,p-NF-κB and NF-κB.Compared with control group,**P＜0.05,***P＜0.001,****P＜0.0001.Compared with AKI group,#P＜0.05,##P＜0.01,###P＜0.001,####P＜0.0001.Figure 3 Effect of isoliquiritigenin on the activity of Smad3/Arid2-IR/NF-κB axis and in AKI kidneys induced by cisplatin

異甘草素是一種易溶于有機(jī)溶劑的異黃酮類化合物,提取自豆科植物甘草,其結(jié)構(gòu)式見圖4,在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中用作生命增強(qiáng)劑,用于治療咳嗽、流感以及解毒[17]。已有研究表明異甘草素具有廣泛的藥理活性,在抗炎、抗氧化、抗癌細(xì)胞增殖等方面療效卓越,主要通過調(diào)控MAPK、PI3K/AKT等通路實(shí)現(xiàn)抗炎作用[18],但對(duì)順鉑誘導(dǎo)AKI所致腎炎癥中的具體作用機(jī)制尚不明確。有研究顯示異甘草素可通過下調(diào)NF-κB通路減輕骨關(guān)節(jié)炎癥水平,在后續(xù)恢復(fù)過程中可下調(diào)TGF-β1/Smad3通路介導(dǎo)的病理性纖維化[19]。我們?cè)谘芯恐型瑯影l(fā)現(xiàn),異甘草素作用后,AKI小鼠腎組織中NF-κB和Smad3的活化程度出現(xiàn)顯著下降,推測(cè)NF-κB是介導(dǎo)腎炎癥的重要分子,它可通過在細(xì)胞核內(nèi)活化并誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)基因的表達(dá),和Smad3共同導(dǎo)致腎損害及后續(xù)修復(fù)過程中的腎間質(zhì)纖維化。我們的研究結(jié)果顯示,異甘草素能有效緩解AKI急性病程中的炎癥,以及減少修復(fù)過程中病理性纖維化。

LncRNA是一種人類非編碼蛋白序列編碼的、轉(zhuǎn)錄后長(zhǎng)度大于200個(gè)堿基的RNA序列,已證實(shí)與包括腫瘤、異常代謝和炎癥等多種病理生理過程相關(guān)[20]。前面我們提到,AKI所致的腎損傷主要涉及炎癥、凋亡等,近年來隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,越來越多與AKI相關(guān)的LncRNA被逐漸發(fā)現(xiàn)。如有研究顯示MEG3可通過結(jié)合miR181b-5p使TNFα活化,導(dǎo)致腎炎癥性損傷[21];PRINS可通過結(jié)合HIF-1α蛋白來加劇NF-κB介導(dǎo)的腎小管細(xì)胞損傷[22];GAS5在缺血再灌注的腎中可直接通過調(diào)節(jié)p53和TSP-1表達(dá)來介導(dǎo)細(xì)胞的損傷和凋亡[23]。近期有研究發(fā)現(xiàn),Arid2-IR是一種可以被高表達(dá)Smad3所調(diào)控、并介導(dǎo)腎炎癥的LncRNA,當(dāng)病變腎中缺失Smad3時(shí),可以解除Arid2-IR的上調(diào),減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡和炎癥[11],同時(shí)Arid2-IR表達(dá)的上調(diào)可加劇NF-κB介導(dǎo)的腎炎癥[24]。那么,異甘草素的抗炎作用是否與調(diào)控LncRNA有關(guān)呢?在本研究中我們重點(diǎn)關(guān)注了Arid2-IR在AKI發(fā)生中的作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Arid2-IR在AKI腎中表達(dá)明顯升高,表明上游的靶基因Arid2-IR被激活。給予異甘草素3 d后,Smad3蛋白磷酸化水平表達(dá)明顯下降,表明異甘草素可以降低AKI腎炎癥中Smad3的活性。值得關(guān)注的是,異甘草素治療后也可明顯抑制Arid2-IR的表達(dá),同時(shí)下調(diào) NF-κB的活性。表明 Arid2-IR可能在Smad3/NF-κB介導(dǎo)的腎炎癥過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

圖4 異甘草素分子式Figure 4 Constitutional formula of isoliquiritigenin

基于以上分析,我們初步得出,異甘草素可通過調(diào)節(jié)Smad3/Arid2-IR/NF-κB軸改善AKI小鼠腎功能,顯著減輕腎炎癥反應(yīng),維護(hù)腎結(jié)構(gòu),延緩了疾病病理生理進(jìn)程,這可能是異甘草素保護(hù)AKI的一個(gè)新機(jī)制,為異甘草素在治療AKI提供了科學(xué)依據(jù)。但關(guān)于Arid2-IR在腎損傷中的確切作用機(jī)制尚需細(xì)胞水平的驗(yàn)證。