基于Caco-2細(xì)胞單層模型對(duì)鹽酸氨溴索吸收機(jī)制的研究

梁秋玲朱葉萌麥子盈王鳳姬龍淑嫻王 弋饒子亮鄺少松

(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,廣東佛山 528248)

AMB是鹽酸溴己新的N-去甲基代謝物,是鹽酸溴己新在環(huán)己基環(huán)上去掉一個(gè)甲基再引入一個(gè)羥基的衍生物,這種結(jié)構(gòu)的改變使AMB具有促進(jìn)排痰、溶解粘液、緩解排痰性咳嗽、抗炎、抗氧化和局部麻醉的作用[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的解剖治療化學(xué)分類系統(tǒng),自1970年以來AMB廣泛用于伴有痰液分泌不正常及排痰功能不良的急性、慢性呼吸系統(tǒng)疾病[2]。除此之外,近些年來AMB的應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣,例如改善帕金森病癥狀,提高肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥大鼠模型的運(yùn)動(dòng)機(jī)能和存活率,抑制肥胖大鼠模型的術(shù)后腹腔粘連[3-5]。AMB還可通過聯(lián)合給藥治療方案治療肺癌,帕金森病、中耳炎、延緩耐藥性等[6-9]。盡管AMB已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床治療,但是AMB仍然存在一定的胃部灼燒、惡心、嘔吐、致敏等副作用,歐盟的藥物警戒風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估委員會(huì)(PRAC)于2015年專門發(fā)表了一篇關(guān)于AMB應(yīng)用安全性的文章,里面就提到AMB存在過敏反應(yīng)的副作用[2]。研究AMB的吸收機(jī)制從而提高其生物利用度可減少不良反應(yīng)的發(fā)生,但是很少有文章研究AMB的吸收機(jī)制。

Caco-2來源于人結(jié)腸腺癌細(xì)胞,可在培養(yǎng)過程中進(jìn)行腸細(xì)胞分化,Caco-2細(xì)胞接種到碳酸聚脂多孔膜等基質(zhì)上,在培養(yǎng)21 d后可自發(fā)形成有極性的,具微絨毛以及緊密連接等類似于小腸上皮細(xì)胞刷狀緣側(cè)的分化特征的單細(xì)胞層[10-11]。因此,Caco-2細(xì)胞可以模擬小腸上皮細(xì)胞,廣泛用于藥物吸收過程中物理和生化屏障的研究[12]。Caco-2細(xì)胞單層模型廣泛應(yīng)用于藥物在小腸吸收的評(píng)價(jià)和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究中,Caco-2細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能類似于人小腸上皮細(xì)胞,表達(dá)與小腸刷狀邊緣上皮相關(guān)的外排轉(zhuǎn)運(yùn)體,例如P-糖蛋白(P-gp)和乳腺癌耐藥蛋白(BCRP2)[13-14]。盡管人腸上皮由多種不同類型的細(xì)胞組成,但主要成分還是小腸上皮細(xì)胞,并且小腸上皮細(xì)胞是形致密的細(xì)胞單層和表達(dá)各種外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的重要組成部分,因此Caco-2細(xì)胞單層模型可用于模擬腸道吸收的藥物篩選模型[15]。

本文通過Caco-2細(xì)胞單層模型研究AMB在腸道中的吸收機(jī)制,探索影響AMB吸收的關(guān)鍵因素,提高其生物利用度。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞Caco-2,購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑與儀器

AMB,批號(hào)100599-201604、METO,批號(hào)100084-201403、阿昔洛韋,批號(hào)140630-201403,均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;羅丹明 123,批號(hào)041818180905,購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液,批號(hào)8119027,GIBCO;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),批號(hào)：FBS00717-1,AUSGENEX;100X非必需氨基酸溶液,批號(hào)8820010101,GENVIEW;100 mmol/L丙酮酸鈉溶液,批號(hào)2003977,GIBCO。24孔Transwell培養(yǎng)板,批號(hào)26217029,Corning;1260高效液相色譜儀,安捷倫科技(中國(guó))有限公司;Millicell ERS-2細(xì)胞電阻儀,德國(guó)Meck millipore。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Caco-2細(xì)胞單層模型的建立

用含10%FBS、1%雙抗、1%非必需氨基酸、1 mM丙酮酸鈉的MEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%匯合時(shí),消化細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至每毫升 2×105個(gè),接種于 24孔Transwell培養(yǎng)板中,頂端(AP)加入0.1 mL細(xì)胞懸液,底端(BL)加入MEM完全培養(yǎng)液0.6 mL,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換一次液,培養(yǎng)7 d后每天換液,連續(xù)培養(yǎng)至21 d。

1.3.2 HPLC檢測(cè)

AMB和METO檢測(cè)的色譜條件用ZORBAX SBC18(150 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱,以磷酸氫二銨-乙腈混合溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至7.0)-乙腈(50∶50)為流動(dòng)相,流速為 1.0 mL/min,柱溫25℃,AMB的檢測(cè)波長(zhǎng)為248 nm,METO的檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm。阿昔洛韋檢測(cè)的色譜條件用ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱,以甲醇-水(10∶90)為流動(dòng)相,流速為1.0 mL/min,柱溫35℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.3.3 Caco-2細(xì)胞單層模型完整性及功能性檢測(cè)

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)至第21天時(shí),將細(xì)胞電阻儀的檢測(cè)電極用70%乙醇滅菌,HBSS沖洗電極晾干。用37℃預(yù)熱的HBSS輕柔地清洗細(xì)胞單層,將細(xì)胞電阻儀的檢測(cè)電極置于Transwell小室內(nèi)外側(cè)檢測(cè)電阻值并按公式(1)計(jì)算TEER,本文所有實(shí)驗(yàn)均選用TEER≥200Ω·cm2的孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將Caco-2單層細(xì)胞用37℃預(yù)熱的HBSS洗滌平衡20 min后,于24孔Transwell培養(yǎng)板的AP端分別加入0.1 mL 50 μg/mL阿昔洛韋(pH 7.4)、20μmol/L羅丹明123溶液(pH 7.4),BL端加入0.6 mL HBSS(pH 7.4)進(jìn)行AP→BL方向的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。于BL端分別加入0.6 mL 50μg/mL阿昔洛韋(pH 7.4)、20μmol/L羅丹明123溶液(pH 7.4),AP端加入0.1 mL HBSS(pH 7.4)進(jìn)行BL→AP方向的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn),于CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后從接收池取出阿昔洛韋檢測(cè)液進(jìn)行HPLC檢測(cè)按公式(2)、(3)計(jì)算Papp和ER,羅丹明123檢測(cè)液用熒光酶標(biāo)儀于507 nm激發(fā)波長(zhǎng),529 nm發(fā)射波長(zhǎng)處檢測(cè)待測(cè)液熒光強(qiáng)度,同時(shí)檢測(cè)0、5、10、20、40 μmol/L 羅丹明 123 溶液的熒光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線再次檢測(cè)TEER值。

注：V：接收池的體積(單位：cm3);Ci：供給池的配制液濃度(單位：μg/mL);Cf：接收池的檢測(cè)液濃度(單位：μg/mL);T：培養(yǎng)時(shí)間(單位：s);A：24孔Transwell培養(yǎng)板小室底面積為0.33 cm2。

1.3.4 濃度對(duì)AMB Papp和ER的影響

將每毫升1.2×105個(gè)的Caco-2細(xì)胞懸液接種于96孔板中,孵育24 h后,分別加入MEM完全培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照組,200μg/mL、100μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL AMB溶液與細(xì)胞共同孵育2 h后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率,選擇細(xì)胞存活率≥90%的AMB濃度做為AMB高劑量組,采用等比稀釋法設(shè)計(jì)AMB低、中劑量組。Caco-2細(xì)胞單層用預(yù)熱的HBSS洗滌平衡后,AP端加入15μg/mL METO(pH 7.4)作為高滲透性對(duì)照、分別加入0.1 mL AMB低、中、高劑量組溶液(pH 7.4),BL端加入0.6 mL HBSS(pH 7.4)進(jìn)行AP→BL方向的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。AP端加入0.1 mL HBSS(pH 7.4),BL端分別加入0.6 mL 15μg/mL METO(pH 7.4)、AMB低、中、高劑量組溶液(pH 7.4)進(jìn)行BL→AP方向的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn),孵育2 h后從接收池中取出檢測(cè)液用HPLC法檢測(cè)METO、AMB的濃度,取樣結(jié)束后,再次檢測(cè)TEER值,確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后Caco-2細(xì)胞單層的完整性。

1.3.5 藥物相互作用對(duì)AMB Papp和ER的影響

Caco-2細(xì)胞單層用預(yù)熱的HBSS洗滌平衡后,AP端分別加入0.1 mL AMB單獨(dú)給藥組溶液(pH 7.4)、METO單獨(dú)給藥組溶液(pH 7.4)、AMB和METO聯(lián)合給藥組溶液(pH 7.4),BL端加入0.6 mL HBSS(pH 7.4)進(jìn)行AP→BL方向的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。AP端加入0.1 mL HBSS(pH 7.4),BL端分別加入0.6 mL AMB單獨(dú)給藥組溶液(pH 7.4)、METO單獨(dú)給藥組溶液(pH 7.4)、AMB和 METO聯(lián)合給藥組溶液(pH 7.4)進(jìn)行BL→AP方向的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn),孵育2 h后從接收池中取出檢測(cè)液用HPLC法檢測(cè)AMB、METO濃度,取樣結(jié)束后,再次檢測(cè)TEER值,確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后Caco-2細(xì)胞單層的完整性。

1.3.6 pH對(duì)AMB Papp和ER的影響

Caco-2單層細(xì)胞用預(yù)熱的HBSS洗滌平衡后,AP端分別加0.1 mL AMB低、中、高pH組溶液,BL端加0.6 mL HBSS(pH 7.4)進(jìn)行AP→BL方向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn),孵育2 h后從接收池中取出檢測(cè)液用HPLC法檢測(cè)AMB濃度,取樣結(jié)束后,再次檢測(cè)TEER值,確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后Caco-2單層細(xì)胞的完整性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 HPLC檢測(cè)

AMB在0～70.31μg/mL濃度范圍內(nèi),其濃度和峰面積呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9999,METO在0～17.00μg/mL濃度范圍內(nèi),其濃度和峰面積呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9995,阿昔洛韋在0～60.98μg/mL濃度范圍內(nèi),其濃度和峰面積呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9997,精密度良好,故HPLC法檢測(cè)AMB、METO、阿昔洛韋重復(fù)性高,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2 Caco-2細(xì)胞單層模型完整性及功能性檢測(cè)

Caco-2細(xì)胞接種于小室培養(yǎng)至第21天時(shí),加樣前和取樣后Caco-2細(xì)胞單層模型TEER值的范圍為(656±26)～(817±96)Ω·cm2,均大于200Ω·cm2,見表1,Caco-2細(xì)胞單層具有良好的致密性[16],同時(shí)低滲透性藥物阿昔洛韋的Papp(AP→BL)＜10-6cm/s,ER＜2,與文獻(xiàn)報(bào)道的Papp值和ER相符[17],符合低滲透性藥物的特性。羅丹明123為P-糖蛋白(pgp)外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物,羅丹明123的Papp(AP→BL)遠(yuǎn)小于1×10-6cm/s,ER值遠(yuǎn)大于2,表明Caco-2細(xì)胞單層模型高表達(dá)p-gp外排轉(zhuǎn)運(yùn)體可以主動(dòng)外排羅丹明123[18-19],見表2。因此,Caco-2細(xì)胞單層模型同時(shí)具備完整性和功能性,可用于轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的研究。

2.3 濃度對(duì)AMB Papp和ER的影響

如圖1A所示,AMB與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)2 h細(xì)胞存活率≥90%的最高濃度為50μg/mL,表明50 μg/mL AMB溶液對(duì)Caco-2細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性,故選擇50μg/mL AMB溶液作為AMB高劑量組,采用等比稀釋法設(shè)計(jì)AMB低、中劑量組考察濃度對(duì)AMB Papp和ER的影響。如圖1B、1C、1D所示,各組在加樣前和取樣后Caco-2細(xì)胞單層模型的TEER值均大于200Ω·cm2,表明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中Caco-2細(xì)胞單層模型保持完整性,依據(jù)Papp(AP→BL)值大小判斷滲透性,Papp(AP→BL)＞10×10-6cm/s為高滲透性藥物,Papp(AP→BL)＜1×10-6cm/s 為低滲透性藥物[20]。 高滲透性對(duì)照組 METO 的 Papp(AP→BL)＞10×10-6cm/s,ER＜2,與文獻(xiàn)報(bào)道的Papp值和ER相符[21],METO為高滲透性藥物,AMB低、中、高劑量組的 Papp(AP→BL)均大于10×10-6cm/s,ER值均小于2,與高滲透性對(duì)照組比較,AMB低劑量組的Papp(AP→BL)值顯著降低(P＜0.01),AMB中、高劑量組無(wú)顯著性差異(P＞0.05),ER值無(wú)顯著性差異(P＞0.05),表明AMB為高滲透性藥物,AMB的滲透性隨著濃度的增加而增高,但對(duì)其吸收機(jī)制無(wú)影響。

2.4 藥物相互作用對(duì)AMB Papp和ER的影響

如圖2所示,各組在加樣前和取樣后Caco-2細(xì)胞單層模型的TEER值均大于200Ω·cm2,表明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中Caco-2細(xì)胞單層模型保持完整性,AMB和METO單獨(dú)給藥和聯(lián)合給藥時(shí),2種化合物的Papp(AP→BL)均大于 10×10-6cm/s,ER 值均小于 2。與METO單獨(dú)給藥組比較,聯(lián)合給藥組的METO Papp(AP→BL)值顯著降低(P＜0.01),與 AMB 單獨(dú)給藥組比較,聯(lián)合給藥組的AMB Papp(AP→BL)值顯著降低(P＜0.05),但是 ER值無(wú)顯著性差異(P＞0.05),表明AMB和METO聯(lián)合給藥會(huì)同時(shí)降低AMB和METO的滲透性,但對(duì)2種化合物吸收機(jī)制無(wú)影響。

表1 Caco-2細(xì)胞單層模型的TEER值(n=3,±s)Table 1 The TEER values of Caco-2 cell monolayer model

表1 Caco-2細(xì)胞單層模型的TEER值(n=3,±s)Table 1 The TEER values of Caco-2 cell monolayer model

組別Groups轉(zhuǎn)運(yùn)方向Transfer direction跨上皮電阻 TEER(Ω·cm2)加樣前Before sample addition取樣后After sampling羅丹明123組Rhodamine 123 group AP→BL 746±56 710±93 BL→AP 721±81 656±26阿昔洛韋組Acyclovir group AP→BL 784±31 758±22 BL→AP 817±96 764±62

表2 羅丹明123、阿昔洛韋的滲透性(n=3,±s)Table 2 The permeability of rhodamine 123 and acyclovir

表2 羅丹明123、阿昔洛韋的滲透性(n=3,±s)Table 2 The permeability of rhodamine 123 and acyclovir

化合物Compound Papp(AP→BL)(cm/s)×10-6 Papp(BL→AP)(cm/s)×10-6滲透性高/低High permeability/Low permeability外排率ER羅丹明123 Rhodamine 123 0.14±1.84 1.80±0.31 低low 10.75±3.35阿昔洛韋Acyclovir 0.88±0.09 1.36±0.13 低low 1.55±0.25

2.5 p H對(duì)鹽酸氨溴索Papp和ER的影響

各組在加樣前和取樣后Caco-2細(xì)胞單層模型的TEER值均大于200Ω·cm2,表明在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中Caco-2細(xì)胞單層模型保持完整性,AMB低、中、高pH組的Papp(AP→BL)均大于10×10-6cm/s,與AMB低pH組比較,AMB中、高pH組的 Papp(AP→BL)值顯著性增加(P＜0.01),表明AMB的滲透性隨著溶媒pH值的升高而增加,見圖3。

圖1 濃度對(duì)鹽酸氨溴索Papp和ER的影響(n=3,±s)Note.METO-High permeability control group,15μg/mL METO.Low-dose AMB group-12.5μg/mL AMB.Medial-dose AMB group-25μg/mL AMB.High-dose AMB group-50μg/mL AMB.Figure 1 Effect of concentration on ambroxol hydrochloride Papp and ER

圖2 藥物相互作用對(duì)鹽酸氨溴索Papp和ER的影響(n=3,±s)Note.METO-METOused alone,15μg/mL METO.AMB used alone-25μg/mL AMB.METO+AMB-Combination of AMB and METO,15μg/mL METO,25μg/mL AMB.Figure 2 Effect of durg-drug interaction on ambroxol hydrochloride Papp and ER

3 討論

AMB是溴己新的人體內(nèi)代謝物,在臨床前和臨床研究中具有廣泛的藥理作用,AMB除了應(yīng)用于急性、慢性呼吸系統(tǒng)疾病外,近些年的研究發(fā)現(xiàn)AMB還具有治療帕金森病,抗腫瘤、增強(qiáng)抗菌活性、促進(jìn)溶酶體外排等藥理作用[22-26],大劑量的AMB還可以有效減少肺癌患者術(shù)后并發(fā)癥的復(fù)發(fā)[27]。然而,AMB在臨床應(yīng)用中存在胃部灼燒、惡心、嘔吐、致敏等副作用,特別是大劑量使用時(shí)其副作用會(huì)更顯著。因此,探索AMB在腸道中的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收機(jī)制,提高其生物利用度可減少臨床使用發(fā)生的副作用。

化合物在Caco-2細(xì)胞單層模型中由AP端的腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)吸收至BL端從而進(jìn)入體循環(huán)中發(fā)揮藥效,因此,Papp(AP→BL)值是衡量化合物透過腸粘膜屏障轉(zhuǎn)運(yùn)吸收至體循環(huán)的關(guān)鍵指標(biāo)。AMB高劑量組的Papp(AP→BL)值是AMB低劑量組的1.28倍,AMB的Papp(AP→BL)值隨著濃度的增加而增高,同時(shí)AMB的ER值小于2,表明AMB的轉(zhuǎn)運(yùn)方式為依賴藥物濃度的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)或易化擴(kuò)散[28-29]。影響被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)和易化擴(kuò)散藥物轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的因素主要是分子大小,電荷、溶解度、脂水分配系數(shù)、藥物間的相互作用[14,30],METO的化學(xué)名為1-異丙氨基-3-[4-(2-甲氧乙基)-苯氧基]-2-丙醇,帶有2個(gè)羥基,解離常數(shù)PKa為9.70,極性表面積PSA為55.0?2,分子量為267.37,METO是水溶性小分子,其轉(zhuǎn)運(yùn)方式為依賴濃度和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的易化擴(kuò)散,其轉(zhuǎn)運(yùn)吸收具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特性,故選擇METO和AMB聯(lián)合用藥,考察AMB與易化擴(kuò)散類藥物聯(lián)合用藥的影響及AMB的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[29,31]。AMB單獨(dú)給藥的Papp(AP→BL)值是AMB和METO聯(lián)合給藥的1.21倍,METO單獨(dú)給藥的Papp(AP→BL)值是AMB和METO聯(lián)合給藥的1.55倍,但是聯(lián)合給藥對(duì)2種化合物的ER值無(wú)顯著影響,表明聯(lián)合給藥會(huì)同時(shí)降低2種化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收,其原因可能為聯(lián)合用藥時(shí)METO和AMB競(jìng)爭(zhēng)性的與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合導(dǎo)致METO和AMB的Papp(AP→BL)值均降低。人體腸道的pH值范圍為5～8[32-33],所以于AP端設(shè)置了3個(gè)不同pH值考察腸液pH對(duì)AMB轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的影響,當(dāng)AP端pH為8.0時(shí),AMB的Papp(AP→BL)值分別是pH6.5的1.95倍、pH7.4的 1.32倍,AMB 的 Papp(AP→BL)值隨著AP端pH值的升高而增高,此結(jié)果可能與AMB的離子化程度高低有關(guān),非離子型藥物比離子型藥物更容易透過腸粘膜屏障進(jìn)入體循環(huán)[31]。AMB為有機(jī)弱堿性,其解離常數(shù)PKa為9.30[34],當(dāng)腸液的pH值越高時(shí),AMB的非離子型越多,離子型越少,轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的速度更快從而提高其生物利用度。

綜上所述,AMB在Caco-2細(xì)胞單層模型上為易化擴(kuò)散轉(zhuǎn)運(yùn)方式,聯(lián)合給藥可能會(huì)降低AMB的吸收,聯(lián)合給藥方案可按先后給藥方式進(jìn)行給藥,2種藥物給藥之間有一定的時(shí)間間隔,同時(shí)提高腸液的pH值可提高AMB的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收, 。