基于JAK2/STAT3/SOCS3信號(hào)通路探討復(fù)方甘草酸苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的防治作用

王 敏李作孝

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,四川瀘州 646000)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種以彌漫性炎性脫髓鞘為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病,目前沒(méi)有任何藥物能夠完全預(yù)防或逆轉(zhuǎn)其漸進(jìn)性神經(jīng)系統(tǒng)病變[1]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是研究MS的經(jīng)典動(dòng)物模型。MS和EAE發(fā)病主要由T細(xì)胞,尤其是CD4+T亞群介導(dǎo)。盡管如此,MS發(fā)病機(jī)制仍不清楚。研究顯示Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)換轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)信號(hào)通路通過(guò)傳導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子信號(hào)參與EAE的發(fā)病過(guò)程[2]。并且有研究顯示STAT3可誘導(dǎo)維甲酸相關(guān)的孤兒受體γt(RORγt)的表達(dá),驅(qū)動(dòng)原始 CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化,從而導(dǎo)致Th17/Treg免疫失衡發(fā)揮致病作用[3]。Th17細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子,主要是IL-17,有助于炎癥和脫髓鞘的發(fā)生。而細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制子(SOCS)蛋白家族能抑制 JAK/STAT信號(hào)通路發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[4]。復(fù)方甘草酸苷(compound glycyrrhizin,CG)是中藥甘草的提取物,具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)神經(jīng)以及促進(jìn)髓鞘再生的作用[5]。受此啟發(fā),本研究建立了小鼠EAE模型,通過(guò)觀察各組小鼠臨床癥狀、脊髓組織炎癥及脫髓鞘情況,同時(shí)檢測(cè)腦組織 JAK2、STAT3及SOCS3蛋白含量及其 mRNA的表達(dá)以及 RORγt、Foxp3mRNA的表達(dá),探討CG對(duì)EAE小鼠的防治作用及其可能機(jī)制,為MS的治療提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SPF級(jí)C57BL/6小鼠50只,8周齡,體重18～22 g,購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0002],于西南醫(yī)科大學(xué)忠山動(dòng)物房[SYXK(川)2018-065]飼養(yǎng),環(huán)境清潔,室內(nèi)通風(fēng)良好,保持室溫25℃左右,12 h明暗交替,食料和飲水充足。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)動(dòng)物福利倫理審查(201912-8),并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑

CG注射液(商品名“美能”,每支20 mL)購(gòu)自衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司;小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白多肽段(MOG35-55)購(gòu)自上海吉爾生化有限公司;福氏完全佐劑和百日咳毒素均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;兔抗JAK2購(gòu)自美國(guó)CST公司;兔抗STAT3、SOCS3及GAPDH抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;山羊抗兔HRP購(gòu)自美國(guó)Aspen公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及EAE模型制作

50只C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為5組：空白組、模型組和CG低、中、高劑量干預(yù)組,每組 10只。將 MOG35-55溶于 PBS中,稀釋為3 mg/L,結(jié)核分支桿菌溶入福氏完全佐劑中稀釋為5 mg/L,兩種液體按1∶1于冰上充分乳化制成油包水狀抗原乳劑。模型組和CG各干預(yù)組每只小鼠于脊柱兩側(cè)分四點(diǎn)皮下注射0.2 mL抗原乳劑,空白組小鼠注射等體積生理鹽水。造模當(dāng)日記作第0天,模型組和CG各干預(yù)組分別于造模第0天和第2天尾靜脈注射百日咳菌毒素提高模型成功率,每只500 ng。

1.3.2 藥物配置及干預(yù)

將CG用生理鹽水稀釋為1/2原液、1/4原液備用,本實(shí)驗(yàn)藥物劑量濃度按照人和動(dòng)物間體表面積等效劑量比值計(jì)算CG低、中、高劑量分別為15、30、60 mg/(kg·d),CG 1/4原液、1/2原液、原液分別給予CG低、中、高劑量干預(yù)組小鼠,則CG各干預(yù)組每只小鼠給藥體積均為30 mL/kg。自造模第1天起,CG低、中、高劑量干預(yù)組每只小鼠分別腹腔注射1/4 CG原液、1/2 CG原液、CG原液30 mL/kg,連續(xù)注射14 d,每日1次。空白組及EAE模型組每只小鼠腹腔注射生理鹽水30 mL/kg,連續(xù)注射14 d,每日1次。

1.3.3 小鼠一般情況觀察及神經(jīng)功能缺損評(píng)分

造模第0天起每天同一時(shí)間觀察小鼠精神情況、飲食活動(dòng),行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。使用改良Kono’5分法[6],神經(jīng)功能缺損評(píng)分如下：0分：正常;0.5分：小鼠僅尾部尖端下垂;1分：尾部拖地;1.5分：?jiǎn)魏笾煌耆c瘓;2分：?jiǎn)魏笾耆c瘓;2.5分：?jiǎn)魏笾c瘓伴另一后肢不完全癱瘓;3分：雙后肢完全癱瘓;3.5分：雙后肢癱瘓伴一前肢癱瘓;4分：四肢癱瘓;5分：死亡。

1.3.4 脊髓組織HE染色

各組小鼠在第30天處死,取脊髓組織,4%多聚甲醛固定36 h后制作石蠟切片。石蠟切片脫蠟后用蒸餾水洗滌。切片置入Harris蘇木素和伊紅染液染色,脫水,封片。

1.3.5 蛋白提取和Western blot分析

各組小鼠在第30天處死,取少量腦組織,剪碎加入RIPA裂解緩沖液,30 min后將所得裂解液4℃離心5 min,取上清液,即為總蛋白溶液。BCA法檢測(cè)蛋白濃度。樣品用SDS-PAGE電泳分離,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后,加入密封溶液,室溫封閉1 h。去盡封閉液,加入一抗稀釋劑,4℃孵育過(guò)夜。一抗稀釋劑為兔抗JAK2、STAT3及SOCS3抗體(1∶1000稀釋)。第2天取出條帶,用TBST洗滌3次,每次5 min。加入二抗稀釋劑(山羊抗兔HRP抗體),室溫孵育30 min。加入ECL混合發(fā)光溶液(A液∶B液=1∶1),暗室中曝光,顯影、定影。使用AlphaEaseFC軟件處理結(jié)果,以GAPDH為內(nèi)部參數(shù),計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.3.6 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

各組小鼠在第30天處死,取大腦組織約100 mg,用TRIpure試劑分離得到總RNA,用EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(ELK Biotechnology,EQ003)按照制造商的說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。 設(shè)計(jì)針對(duì) JAK2、STAT3、SOCS3、RORγt及Foxp3的引物(所有引物均由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成,見(jiàn)表1,在StepOneTMReal-Time PCR儀(Life technologies公司)上擴(kuò)增基因片段,每個(gè)樣品均作3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)在95℃熱啟動(dòng)3 min,然后在95℃進(jìn)行10 s(變性)、58℃進(jìn)行30 s(復(fù)性)和72℃進(jìn)行30 s(延伸),變性、復(fù)性、延伸三個(gè)過(guò)程循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)部參數(shù),通過(guò)2-ΔΔCT方法計(jì)算基因含量的相對(duì)表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 22.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和處理數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)中獲得的所有數(shù)據(jù)均為計(jì)量數(shù)據(jù),表示方法為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)。單因素方差分析用于多組間比較,LSD-t檢驗(yàn)用于各組之間的兩兩比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠臨床表現(xiàn)及神經(jīng)功能缺損評(píng)分

空白組小鼠未發(fā)病。模型組及CG各干預(yù)組在第8～9天開(kāi)始先后出現(xiàn)臨床癥狀,主要表現(xiàn)為飲食減少、體重下降、活動(dòng)減慢,行走時(shí)可見(jiàn)拖尾;第14～17天后迅速達(dá)發(fā)病高峰,表現(xiàn)為不同程度的肢體癱瘓甚至死亡,經(jīng)歷短暫的高峰期后,癥狀逐漸緩解,肢體癱瘓逐漸恢復(fù),見(jiàn)圖1。經(jīng)藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)：與模型組比較,CG各干預(yù)組小鼠臨床癥狀減輕,多表現(xiàn)為尾部尖端下垂、單后肢癱瘓或不完全癱瘓,劑量越大癥狀越輕。且與模型組比較,CG各干預(yù)組最高神經(jīng)功能缺損評(píng)分及累計(jì)神經(jīng)功能缺損評(píng)分降低(P＜0.05),干預(yù)劑量越大,最高神經(jīng)功能缺損評(píng)分及累計(jì)神經(jīng)功能缺損評(píng)分越低(P＜0.05),見(jiàn)表2。

2.2 各組小鼠脊髓病理學(xué)改變

空白組脊髓組織幾乎未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),髓鞘結(jié)構(gòu)相對(duì)正常;EAE模型組及CG各干預(yù)組脊髓組織有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),以單核細(xì)胞為主,脊髓前索及側(cè)索白質(zhì)處髓鞘結(jié)構(gòu)松散,崩解脫失,但與EAE模型組比較,CG各干預(yù)組脊髓組織的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及脫髓鞘程度均明顯減輕,見(jiàn)圖2。

2.3 各組小鼠腦組織JAK2、STAT3及SOCS3蛋白的表達(dá)

與空白組比較,模型組JAK2、STAT3的蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05),負(fù)性調(diào)控因子SOCS3蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05);經(jīng)藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)：與模型組比較,CG各劑量干預(yù)組JAK2、STAT3蛋白表達(dá)均明顯降低(P＜0.05),負(fù)性調(diào)控因子SOCS3蛋白表達(dá)升高(P＜0.05),且干預(yù)劑量越大,蛋白表達(dá)變化越明顯(P＜0.05),見(jiàn)圖3、表3。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequence

圖1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分Figure 1 Neurological deficit score of each group

表2 模型組及CG各干預(yù)組最高神經(jīng)功能缺損評(píng)分及累計(jì)神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較(n=10)Table 2 The highest neurological deficit score and the cumulative neurological deficit score were compared between model group and three CG intervention groups

圖2 各組小鼠脊髓組織HE染色Note.A,Control group.B,Model group.C,Low-dose CGgroup.D,Medium-dose CGgroup.E,High-dose CGgroup.Figure 2 HE staining of spinal cord tissue in each group of mice

圖3 各組Western blot檢測(cè)JAK2、STAT3、SOCS3表達(dá)情況Note.1,Control group.2,Model group.3,Low-dose CG group.4,Medium-dose CG group.5,High-dose CG group.Figure 3 Western blot analysis showing the expressions of JAK2、STAT3、SOCS3 in the mice

2.4 各組小鼠腦組織的 JAK2 mRNA、STAT3 mRNA及SOCS3 mRNA的表達(dá)

與空白組比較,模型組 JAK2 mRNA、STAT3 mRNA升高(P＜0.05),SOCS3 mRNA降低(P＜0.05);經(jīng)藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)：與EAE模型組比較,CG各劑量干預(yù)組JAK2 mRNA、STAT3 mRNA均顯著降低(P＜0.05),SOCS3 mRNA 顯著升高(P＜0.05),與劑量呈依賴性(P＜0.05),見(jiàn)表4。

2.5 各組小鼠腦組織Th17/Treg細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

與空白組比較,模型組RORγt mRNA升高(P＜0.05),Foxp3 mRNA降低(P＜0.05);經(jīng)藥物干預(yù)后發(fā)現(xiàn)：與模型組比較,CG各劑量干預(yù)組 RORγt mRNA顯著降低(P＜0.05),Foxp3 mRNA顯著升高(P＜0.05),干預(yù)劑量越大,作用效果越明顯(P＜0.05),見(jiàn)表 5。

表3 各組小鼠腦組織JAK2、STAT3及SOCS3蛋白的表達(dá)Table 3 Expression of JAK2,STAT3 and SOCS3 proteins in brain tissues of mice in each group

表4 各組小鼠腦組織JAK2 mRNA、STAT3mRNA及SOCS3 mRNA的表達(dá)Table 4 Contents of JAK2 mRNA,STAT3mRNA and SOCS3 mRNA in brain tissues of mice in each group

表5 各組小鼠腦組織Th17/Treg細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)Table 5 Expression of key transcription factors of Th17/Treg cells in brain tissue of mice in each group

3 討論

MS是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病,其主要特征為多中心炎癥和脫髓鞘[7]。EAE是國(guó)際公認(rèn)的研究MS病理過(guò)程的理想動(dòng)物模型[8]。目前治療MS的疾病修飾藥物是否可以延緩臨床進(jìn)展以及是否安全仍存在爭(zhēng)議。CG是以甘草酸(Glycyrrhizic acid,GL)(亦稱甘草甜素)為主要活性物質(zhì),并輔以甘氨酸、半胱胺酸以及蛋氨酸等組成的復(fù)方制劑。而甘草次酸(Glycyrrhetinic acid,GA)是GL的主要活性代謝產(chǎn)物,是GL的非糖部分,被認(rèn)為是GL大部分藥理特性的原因。CG為甘草酸類第二代制劑,以β體甘草酸單銨鹽為主要成分。甘草具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)神經(jīng)以及促進(jìn)髓鞘再生的作用,且被廣泛用于濕疹、蕁麻疹、過(guò)敏性紫癜、銀屑病、潰瘍性結(jié)腸炎等免疫相關(guān)疾病的治療。Tabuchi等[9]研究顯示GA可以滲透血腦屏障到達(dá)大腦。Jia等[10]用甘草甜素治療BALB/c小鼠模型的坐骨神經(jīng)損傷,結(jié)果表明,與甘草甜素低劑量組或?qū)φ战M相比,甘草甜素高劑量和中劑量能促進(jìn)坐骨神經(jīng)髓鞘形成。Li等[11]研究發(fā)現(xiàn),GL可以通過(guò)降低HMGB1水平,滅活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞以及抑制神經(jīng)元損傷來(lái)降低EAE的嚴(yán)重程度。受此啟發(fā),本實(shí)驗(yàn)建立MS的動(dòng)物模型EAE,并使用CG干預(yù)模型,以期尋找MS的潛在治療藥物。結(jié)果顯示：與EAE模型組比較,CG各干預(yù)組小鼠肢體癱瘓程度減輕,脊髓組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及脫髓鞘程度明顯減輕。另外,CG各干預(yù)組最高神經(jīng)功能缺損評(píng)分及累計(jì)神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低,且呈劑量依賴性。表明CG能減輕EAE小鼠的病情進(jìn)展,可能對(duì)EAE小鼠發(fā)揮防治作用。

JAK/STAT信號(hào)通路能調(diào)控大量炎性細(xì)胞因子(如 IL-6、IL-12、IL-22、IL-23 等)的生物學(xué)活動(dòng),廣泛參與炎癥、細(xì)胞增殖及免疫調(diào)節(jié)等病理生理過(guò)程[12]。已證實(shí)JAK/STAT信號(hào)通路的異常活躍與EAE發(fā)病密切相關(guān)[13]。至今發(fā)現(xiàn)JAKs有四種亞型,分別為JAK1-3和TYK2。STAT位于JAK下游,是信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子,STAT家族包括STAT1-4、STAT5a、STAT5b以及 STAT6。 當(dāng)細(xì)胞外信號(hào)(IL-6等)與目標(biāo)細(xì)胞對(duì)應(yīng)受體結(jié)合,JAKs被激活,胞漿中STATs單體磷酸化形成二聚體,二聚體進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與特定的DNA序列結(jié)合,誘導(dǎo)目標(biāo)基因表達(dá),以調(diào)控特定細(xì)胞因子的表達(dá)[14]。不同的T細(xì)胞亞群被這些特定細(xì)胞因子激活后,又產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子來(lái)驅(qū)動(dòng)炎癥,開(kāi)啟持續(xù)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),引起腦、脊髓、視神經(jīng)的慢性炎癥和神經(jīng)元變性,促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和脫髓鞘[2,15]。而SOCS是該通路的主要負(fù)調(diào)控機(jī)制之一。SOCS家族成員有SOCS1-7及CIS[16]。研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物模型[17-18]和體外實(shí)驗(yàn)[19]中,GL均顯示出抑制JAK/STAT信號(hào)途徑的作用,從而減輕了炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組比較,EAE模型組JAK2、STAT3的蛋白表達(dá)量及其mRNA含量均上調(diào),同時(shí)SOCS3在EAE小鼠體內(nèi)的表達(dá)明顯下調(diào),且以高劑量組為甚,表明負(fù)性調(diào)控因子SOCS3的缺失及JAK2、STAT3的異常活化均參與EAE小鼠的發(fā)病過(guò)程,這與既往研究一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),與EAE模型組比較,CG干預(yù)后能降低JAK2、STAT3蛋白及其mRNA的表達(dá),同時(shí)SOCS3的蛋白及其mRNA的表達(dá)增高,且以高劑量組為甚。由此證明,CG可能通過(guò)上調(diào)負(fù)性調(diào)控因子SOCS3以及抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路的異常活化,以抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),減輕EAE小鼠臨床癥狀,發(fā)揮對(duì)EAE小鼠的防治作用。

另外JAK/STAT信號(hào)通路還能調(diào)控細(xì)胞影響幼稚CD4+T細(xì)胞的分化方向參與MS/EAE發(fā)病。眾所周知,IL-6通過(guò)激活T細(xì)胞gp130-STAT3途徑直接促進(jìn)Th17細(xì)胞的發(fā)育[20]。Th17細(xì)胞能高分泌IL-17 A、IL-17F、IL-22和IL-23,介導(dǎo)自身免疫反應(yīng),在MS/EAE中發(fā)揮致病作用,RORγt是誘導(dǎo)幼稚CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[21-22]。而STAT3是誘導(dǎo)RORγt所必需的。Yang等[23]研究揭示了在STAT3缺陷的Th細(xì)胞中RORγt的表達(dá)大大降低,同時(shí)觀察到轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白P3(Foxp3)表達(dá)升高。因此,STAT3和RORγt在幼稚CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞中起關(guān)鍵作用。Treg細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-10和TGF-β抑制自身免疫性疾病,與Th17細(xì)胞相互拮抗以維持免疫穩(wěn)態(tài),Foxp3是Treg細(xì)胞發(fā)育和發(fā)揮功能的主調(diào)節(jié)因子[24-25]。據(jù)報(bào)道,GL可以有效抑制Th17的分化和信號(hào)傳導(dǎo)[26]。本研究發(fā)現(xiàn),CG明顯下調(diào)了EAE小鼠的STAT3和RORγt的表達(dá),同時(shí)Foxp3的表達(dá)上調(diào)。提示CG可以上調(diào)保護(hù)性因子Foxp3的表達(dá)并抑制炎癥性因子RORγt的表達(dá)以糾正Th17/Treg免疫失衡,從而使Th17/Treg細(xì)胞平衡向有利于Treg細(xì)胞的方向分化,減輕EAE小鼠炎性反應(yīng)。

綜上所訴,CG對(duì)EAE小鼠防治作用的機(jī)制可能與上調(diào)負(fù)性調(diào)控因子SOCS3的表達(dá),抑制JAK/STAT信號(hào)通路以及影響Th17/Treg細(xì)胞平衡有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)提示CG可能是MS的一種潛在治療劑,然而,目前CG對(duì)EAE研究甚少,且EAE發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,CG調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路的細(xì)胞外信號(hào)尚不明確以及是否涉及其他信號(hào)通路有待進(jìn)一步探討。