Tet1蛋白對HEK293T細胞增殖、周期及凋亡的影響

莫 晶楊紅蘭劉 含金 皎范安然張 鵬周艷華*舒莉萍*

(1.貴州醫科大學細胞工程生物醫藥技術國家地方聯合工程實驗室,貴州省再生醫學重點實驗室,貴州醫科大學免疫教研室,貴陽 550004;2.中國醫學科學院成體干細胞轉化研究重點實驗室,組織工程與干細胞實驗中心,貴陽 550004;3.貴州醫科大學附屬醫院兒科,貴陽 550004)

腫瘤發生和發展伴隨著基因組甲基化水平的巨大改變[1],具體表現為腫瘤基因組整體低甲基化,而腫瘤抑制因子往往存在局部高甲基化[2]。哺乳動物細胞中基因組的甲基化主要由DNA甲基轉移酶建立并維持的[3],而基因組中的去甲基化主要認為是由于細胞內DNA復制之后甲基轉移酶功能失效造成的[4]。除了DNA復制導致的DNA去甲基化,據報道,10-11易位蛋白(ten-eleven translocation,Tet)也參與DNA去甲基化,調節細胞內的DNA甲基化[5]。

哺乳動物的Tet蛋白家族包括三個成員：Tet1、Tet2、Tet3。它們都具有羧基末端的催化結構域(catalytic domain,CD),即富含半胱氨酸區域(Cysrich)和雙鏈β螺旋區域(DSBH),功能上都具有催化5-甲基胞嘧啶(5mC)轉變為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)氧化活性[6]。有研究報道,Tet蛋白在腫瘤發生和發展過程中發揮重要作用。Tet蛋白與血液惡性腫瘤[7-8]以及實體瘤(包括結腸癌[9]、乳腺癌[10]和前列腺癌[11])相關,編碼Tet蛋白的基因突變失去催化5mC轉變為5hmC的去甲基化能力導致腫瘤發生[12]。因此,通過調節Tet蛋白氧化活性來改變基因甲基化水平,可能是腫瘤的治療靶點之一。另外,Tet蛋白在干細胞的多能性獲得[13-14]和喪失[15]過程中發揮重要作用。本實驗旨在以HEK293T為模型,構建誘導Tet1CD過表達的穩轉細胞系,初步探索Tet1蛋白對細胞增殖、凋亡及周期的影響,為進一步研究Tet蛋白功能及相關機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

質粒pTRE-Tight_IRES_RFP_RPBSA_M2rtTA_Puro和 pCAG_EGFP_Tet1CD信息參見文獻[16],pCMV(CAT)T7-SB100哺乳轉座質粒(睡美人)(淼靈生物)。

1.2 主要試劑與儀器

割膠回收試劑盒、限制性內切酶NotⅠ、SfaAⅠ、T4 DNA連接酶(ThermoFisher);DH5α感受態及質粒提取試劑盒(天根);轉染試劑 LipofectamineTM3000(Invitrogen);Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Gbico);細胞培養基DMEM、青鏈霉素混合液、FBS(BI);多西環素(Doxycycline,Dox)、嘌呤霉素(Puromycin,Puro)、亞甲藍、β-actin(Sigma);酚氯仿抽提 DNA試劑、蛋白裂解液(索萊寶);TGX Stain-FreeTMFASTCASTTMAcrylamide Kit、Bio-Dot apparatus微濾裝置(Biorad);大鼠源 anti-Tet1(mAb)、兔源anti-5hmC(pAb)(Activemotif);HRP-羊抗兔二抗、HRP羊抗大鼠二抗(ThermoFisher);凋亡檢測試劑盒和周期檢測試劑(美國BD);流式細胞儀(ACEA novocyte);人胚胎腎細胞系(HEK293T)(中喬新舟)。

1.3 實驗方法

1.3.1 質粒構建及酶切驗證

通過限制性內切酶NotⅠ和SfaAⅠ37℃過夜雙酶切pTRE-Tight_IRES_RFP_RPBSA_M2rtTA_Puro和pCAG_EGFP_Tet1CD質粒。經瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收目的片段。連接后經DH5α感受態轉化,在氨芐霉素抗性的瓊脂平板上涂板,37℃過夜培養。挑取單克隆菌落,擴大培養后提取重組質粒。

1.3.2 細胞轉染與篩選

(1)細胞的準備

人胚胎腎細胞系(HEK293T)按每孔5×105接種至六孔板內,過夜培養至細胞融合度達60%～80%時進行脂質體轉染。

(2)質粒轉染：

A,稀釋脂質體：125 μL opti-MEM+5 μL lipofectation;B,稀釋DNA：125 mL opti-MEM+2.5 μg DNA(重組質粒和“睡美人”質粒各1.25μg)+5μL P3000;各自混勻后將稀釋后的脂質體加入DNA管中,吹打混勻后室溫下放置15 min。將脂質體-DNA混合物逐滴滴加至六孔板內。培養于含10%FBS和1%青鏈霉素的DMEM培養基,置于37℃,5%CO2孵箱中常規培養。

(3)細胞篩選

雙質粒共轉染后24 h,予細胞換液處理,持續用含2μg/mL嘌呤霉素的培養基對轉染的細胞進行壓迫篩選,能正常生長的證明是轉染成功的細胞。

1.3.3 細胞鑒定

(1)Western blot檢測Tet1CD蛋白表達

RIPA裂解液(索萊寶)提取構建好的穩轉細胞的細胞總蛋白,分為Dox誘導組和未誘導組(對照組),100℃ 變性。TGX Stain-FreeTMFASTCASTTMAcrylamide Kit配制10%電泳膠對各組蛋白進行電泳,曝光觀察各泳道內總蛋白情況后轉膜至硝酸纖維膜(NC膜)上,3%脫脂奶粉室溫下封閉1 h,加入1∶5000 Tet1一抗室溫下孵育1 h,PBST洗滌3次,每次10 min。1∶5000辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗大鼠二抗孵育1 h,PBST洗滌3次,每次10 min。ECL化學發光液顯影。

(2)DNA blot檢測5hmC信號

酚氯仿法提取293T(Tet1CD)+Dox組和293T(Tet1CD)細胞系的基因組DNA(gDNA)后,將兩組gDNA倍比稀釋,使得等體積溶液內DNA分別為400 ng、200 ng、100 ng、50 ng,加入20×SSC 使其終濃度變為 6×SSC。將各管中的 gDNA經 Bio-Dot apparatus微濾裝置轉膜至NC膜上,晾干后亞甲藍染色5 min后定量兩組gDNA的同一性。在兩組上樣的gDNA同一性一致的情況下,按上述步驟稀釋gDNA后進行100℃ 10 min熱變性,變性后立即插入冰中,在冰上加入20×SSC使其濃度為6×SSC。轉膜后用3%脫脂奶粉在25℃封閉1 h。1∶10000的5hmC一抗室溫孵育1 h。PBST洗滌3次,每次10 min。1∶5000的HRP-羊抗兔IgG室溫孵育1 h。PBST洗滌3次,每次10 min。ECL化學發光顯影。

1.3.4 檢測Tet蛋白對于細胞周期、凋亡及增殖的影響

(1)細胞分組

空白對照組HEK293T：用單純完全培養基培養的HEK293T;陰性對照組 HEK293T+Dox：用含1μg/mL多西環素的完全培養基培養HEK293T;實驗組HEK293T(Tet1CD)+Dox：用1μg/mL多西環素的培養基培養穩轉細胞293T(Tet1CD)以誘導Tet1CD過表達。

(2)細胞增殖

將細胞按上述分組,各接種5000個細胞至12孔板內分組培養。 在24 h、48 h、72 h、96 h分別將各孔細胞消化后取相同體積的細胞懸液用計數板顯微鏡下計數。

(3)細胞凋亡和細胞周期

將細胞按上述分組培養,將培養96 h后的細胞分別消化計數,收集大約2×105個細胞進行AnnexinⅤ-FITC/7AAD染色,15 min后在流式細胞儀上進行凋亡檢測。同時每組收集大約1×105萬個細胞,加入75%預冷乙醇4℃固定過夜,加入 PI染色10 min后在流式細胞儀上進行周期檢測。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 重組質粒構建和酶切驗證

如圖1A所示,本實驗構建可誘導型(tet operator)、RFP(dsRed)標記、表達Tet1CD的重組質粒,該質粒同時具有氨芐的原核抗性和嘌呤霉素的真核抗性。將重組質粒與原質粒經NotⅠ和SfaAⅠ雙酶切后進行電泳驗證。結果顯示,重組質粒(圖1B,泳道2)在大約2000 bp位置和8000 bp位置附近各有一條帶,與理論上2084 bp和7145 bp的虛擬酶切相符。說明重組質粒構建正確。

2.2 Western blot驗證Tet1CD蛋白的表達

如圖2結果顯示,當所有樣品中細胞總蛋白加載量無顯著差異時(P=0.6575);與未加Dox誘導的對照組相比,誘導組細胞中Tet1蛋白表達量顯著增加,P＜0.001。說明構建的細胞系中Tet蛋白可以穩定表達。

2.3 DNA dot blot檢測Tet1CD過表達細胞系中5hmC的含量

如圖3所示,與對照組相比,誘導組(+Dox)基因組中的5hmC信號顯著增加,P＜0.001。說明構建的細胞系中Tet1蛋白具有催化產生5hmC的功能。

圖1 重組質粒構建及酶切驗證Note.A,Illustration of recombinant plasmid.B,Electrophoresis result of plasmid after double digestion by NotI and SfaAI(M,DNA marker.lane 1,double digestion of skeleton plasmid.lane 2,double digestion of recombinant plasmid.lane 3,double digestion of target fragment plasmid).Figure 1 Construction of recombinant plasmid and verification by enzyme digestion

圖2 Western blot檢測Tet1CD蛋白表達Note.A,Tet1 antibody staining diagram on the left,and TGX Stain-FreeTM FASTCASTTM Acrylamide Kit prepared total protein staining diagram on the right.B,Compared with the non-induced group,***P＜0.001.Figure 2 Detection of Tet1CD protein expression via Western blot

圖3 DNA Dot blot檢測基因組中的5hmC含量Note.The left,Methylene blue staining of fold-diluted DNA in control and induction groups.The right,5hmCsignal of fold-diluted DNA in control and induction groups.B,Compared with the non-induced group,***P＜0.001.Figure 3 Detection of 5hmC content in the genome via DNA Dot blot

2.4 Tet1CD過表達對細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡及的影響

2.4.1 Tet1蛋白對細胞增殖的影響

如圖4所示,陰性對照組(HEK293T+Dox)與空白對照組(HEK293T)間細胞增殖無顯著差異(P=0.83)。但,與陰性對照組(HEK293T+Dox)比,Tet1蛋白過表達對細胞增殖有明顯抑制作用(P＜0.0001)。說明Tet1蛋白對細胞增殖具有抑制作用。

2.4.2 Tet1蛋白對細胞周期的影響

如圖5A所示,實驗組HEK(293T)+Dox周期中G2期占比為 25.47%,空白對照組 HEK293T為20.43%,陰性對照組HEK293T+Dox為20.69%。與空白對照組和陰性對照組相比,實驗組的G2期分別增加了24.67%和23.11%(圖中顯示單次實驗結果)。如圖5B所示,為實驗重復3次后的統計結果,與兩對照組相比,實驗組的細胞周期阻滯在G2期(P＜0.05),而G1、S期未見顯著差異。

2.4.3 Tet1蛋白對細胞凋亡的影響

如圖6A左上所示,實驗組細胞不經任何染色在流式細胞術檢測凋亡的為FITC陰性,7AAD陰性(FITC-,7AAD-)的范圍,說明細胞中RFP的表達不會影響細胞凋亡的檢測。如圖6A所示,空白對照組(圖6A右上)、陰性對照組和實驗組的早期凋亡(FITC+,7AAD-)有明顯差異,比例分別為1.39%、0.85%和2.83%,但是晚期凋亡無明顯變化。與陰性對照組相比,實驗組細胞早期凋亡比例增加232.94%;而與空白對照組相比,Tet1蛋白過表達的細胞早期凋亡比例增加103.60%(圖中顯示單次實驗結果)。如圖6B所示,實驗重復3次后,實驗組早期凋亡比例較陰性對照組和空白對照組顯著升高(P＜0.05)。說明Tet1蛋白對于細胞早期凋亡具有促進作用。

3 討論

表觀遺傳學調控腫瘤的發生、發展和預后。表觀遺傳學包括DNA甲基化、基因組印跡、組蛋白修飾等哺乳動物細胞基因組中的胞嘧啶甲基化是在表觀遺傳學中是代表性修飾,主要發生在CpG島,其甲基化水平往往與基因的轉錄活性呈負相關[17]。Tet1蛋白是Tet蛋白家族中的重要成員之一,參與介導DNA去甲基化的過程,在胚胎發育、骨髓造血及生殖細胞生成等過程中有著重要作用[18-19]。

Tet蛋白的CD結構域是靠近羧基端的催化結構域,具有氧化活性,能將5-甲基胞嘧啶(5mC)轉變為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC),進一步依次氧化成5-醛基胞嘧啶(5fC),5-羧基胞嘧啶(5CaC)[20]。據多篇文獻報道[8,11,21-25],Tet蛋白氧化5mC產生的中間體5hmC,其水平的高低與多種腫瘤,如血液惡性腫瘤、胃癌、前列腺癌、肝癌及結腸癌等有著密切的關系。結合Tet蛋白的氧化功能和5hmC與腫瘤的關系,提示可通過調節Tet氧化活性改變5hmC含量,降低DNA甲基化水平,從而改變腫瘤的發展進程。

圖4 細胞計數法檢測Tet1蛋白對于細胞增殖的影響Note.Compared with the blank control group and the negative control group,****P＜0.0001.Figure 4 Detection of the effect of Tet1 protein on cell proliferation by cell counting

圖5 流式細胞術檢測Tet1蛋白對細胞周期的影響Note.A,The effect of Tet1 protein on thecycle wasdetected by flow cytometry.B,Proportion of each period in cell cycle.Compared with the blank control group and the negative control group,*P＜0.05.Figure 5 Effect of Tet1 protein on cell cycle by flow cytometry

圖6 流式細胞術檢測Tet蛋白對細胞凋亡的影響Note.A,Top left,Cells in the experimental group were directly adjusted without fluorescence staining for apoptosis by staining with apoptotic reagent.Top right,Apoptosis in the blank control group.Bottom left,Apoptosis in the negative control group.Bottom right,Apoptosis in test group.B,Proportion of early apoptotic cells among different groups.Compared with the blank control group and the negative control group,*P＜0.05.Figure 6 Effect of Tet protein on apoptosis by flow cytometry

本研究通過在HEK293T細胞上構建了誘導型Tet1CD過表達的穩轉細胞系,用 Western blot和DNA dot blot方法在蛋白水平和生物學功能水平上鑒定穩轉系的建立,結果顯示穩轉系構建成功并且Tet1蛋白具有催化產生5hmC的功能。通過細胞計數的方法觀察到Tet1蛋白對于細胞增殖具有抑制作用。之前有研究發現,Tet蛋白家族中的Tet2能夠抑制細胞增殖[26],暗示Tet家族蛋白可能在細胞增殖過程中具有保守的作用,但是Tet家族蛋白影響細胞增殖是否依賴于其催化5hmC的功能還需要進一步的研究。為了探討Tet1蛋白影響細胞增殖的機制,本研究通過流式細胞術方法發現Tet1蛋白導致G2時期的細胞比例增加,而G1和S期未見顯著差異,說明Tet1蛋白可能通過抑制細胞周期使細胞處于G2時期最終導致細胞增殖變慢。另外,本研究還發現Tet1蛋白促進細胞早期凋亡,凋亡的細胞可能最終發生死亡,從而也會影響到細胞增殖的速度。

由于HEK293是胚胎腎永生化的細胞系,具有高度異常的核型,并組成性表達Ad5 E1A/E1B蛋白,從而抑制 pRB/p53通路。高度傳代下的HEK293細胞可誘導裸鼠腫瘤的形成[27]。而HEK293T細胞系作為HEK293細胞衍生物,區別在于其穩定轉染了編碼SV40大T抗原溫度敏感型突變體質粒,因此更具致瘤性[28]。

綜上所述,本文通過在類癌細胞系HEK293T中過表達Tet1蛋白的結果可知,Tet1蛋白促進對HEK293T細胞凋亡、促使細胞阻滯在G2時期,抑制細胞增殖,提示了通過調節Tet蛋白對細胞生長有著重要的意義。一方面,通過調節Tet蛋白的表達,改變細胞的增殖速度,可能有利于細胞在體外高效擴增。另一方面,通過調節Tet蛋白的表達可能會控制細胞的增殖速度和凋亡狀態,從而延緩腫瘤的發展,或為腫瘤治療的靶點之一。但是,如何在腫瘤細胞中精確的控制Tet1蛋白表達以及Tet1蛋白如何影響細胞增殖的作用機制還需要進一步的闡明。