MD1的缺失通過激活TLR4/MyD88信號通路增加肥胖小鼠室性心律失常的易感性

胥 良牛思泉袁義強楊少華趙育潔

(鄭州市第七人民醫(yī)院心血管內科,鄭州 450000)

肥胖可導致代謝綜合征,也可以導致人體和動物的心臟結構和功能紊亂,已有研究證明,肥胖可增加室性心律失常(ventricular arrhythmia,VA)和心肌猝死的風險[1]。此外,據報道,在VA病理和生理學中肥胖與該病的發(fā)病機制相互關聯(lián)[2],一方面,肥胖可引起心肌肥厚、心室纖維化,并且損害左心室的收縮和舒張功能。另一方面,肥胖后離子通道整體水平的穩(wěn)態(tài)調節(jié)會引起細胞離子通道重構,導致電流綜合特性電位的變化,從而影響心肌功能。上述兩種機制均能增加VA發(fā)病的風險,但目前肥胖的VA的治療手段有限,所以需要尋找與肥胖誘導VA相關的關鍵因子。toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)是一種同源性識別體,TLR4的通路被認為是肥胖誘導的炎癥反應主要因素之一[3]。TLR4/MyD88能夠激活蛋白激酶2,在肥胖相關的心臟重構中起著重要作用[4]。因此說明 TLR4/MyD88的通路在肥胖導致的心室重構中起著至關重要的調控作用,可能是肥胖導致VA的關鍵通路。骨髓分化因子1(myeloid differentiation 1,MD1)是TLR4/MyD88信號通路生理負調控因子,MD1在心臟中廣泛表達,在慢性壓力超負荷的情況下,MD1缺失會加重心臟重構[5]。此外我們還發(fā)現(xiàn)了,MD1缺失會增加肥胖小鼠的心肌擴張能力,增加心房顫動的易感性。因此,本研究主要探討高脂飲食誘導的VA的相關機制,為MD1在高脂飲食誘導的VA發(fā)生發(fā)展中提供了可靠依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性鼠MD1基因敲出C57BL/6J小鼠(MD1-ko-)16只,4～6周,SPF級,體重在17～20 g。SPF級4～6周齡雄性C57BL/6J小鼠16只,體重在17～20 g,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[SCXK(湘)2018-0009],飼養(yǎng)在鄭州大學實驗動物中心[SYXK(豫)2018-007],光照周期為12 d,在IVC籠內飼養(yǎng),每個籠子5～6只,所有小鼠在溫度為21℃～25℃,濕度在40%～55%條件下。在動物實驗的過程中嚴格貫徹3R原則,動物使用的倫理審批號(IACUC-20180809)。共計分為4組,每組8只,分別為WT正常組、MD1-ko-正常組、WT高脂組、MD1-ko-高脂組。WT高脂組和MD1-ko-高脂組小鼠喂養(yǎng)20周高脂肪食物(含60%的脂肪,購自美國Research Diets公司)。WT正常組和MD1-ko-正常組正常飼料(含10%的脂肪,購自美國Research Diets公司)喂養(yǎng)。每組小鼠每周稱重,檢測并記錄20周后小鼠的體重(BW)、血糖值、總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇水平,麻醉后處死,檢測小鼠的心臟重量(HW),計算小鼠HW/BW的比值。

1.2 主要試劑與儀器

蛋白定量試劑盒(批號 S20060042),購自Thermo公司;蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(批號C0105),購自碧云天生物技術;天狼星紅染色試劑(批號YM-S1459),購自上海經科化學科技有限公司;使用以下抗體：Anti-TLR4(CST,#1053)、Anti-MyD88(CST,#7832)、Anti-P-CAMKII(CST,#5632)、Anti-TGF-β1(CST,#4630)、Anti-CollagenI(CST,#6549)、Anti-CollagenIII(CST,#7643)、Anti-GAPDH(CST,#3821),購自美國Cell Signaling公司。賽多利斯Quintix612型號的動態(tài)電子天平,購自賽多利斯公司;瑞沃德R450小動物麻醉機,購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司;TDZ5-WS型臺式低速離心機,購自湘儀離心機儀器有限公司;RM2016輪轉石蠟切片機,購自德國徠卡公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠心電圖和超聲心動圖分析

小鼠喂養(yǎng)20周后,吸入濃度為2%的異氟醚1.5μL,麻醉后,采用日本心電圖十二導聯(lián)同步心電圖檢查儀,按照常規(guī)進行操作,把電極放置于皮下,接近心電圖表面導聯(lián),記錄小鼠心率,主要包括RR間距、PR間距、QRS持續(xù)時間、QTc間期。在使用飛利浦公司生產的彩色多普勒顯像儀,15MZ探頭對麻醉小鼠的左心室功能進行超聲心動圖評估,測量左心室舒張末期內徑(LVEDd)、左心室收縮末期內徑(LVEDs)、左室短軸縮短率(LVFS)、左心室射血分數(shù)(LVEF)。

1.3.2 Western blot檢測

對WT正常組、MD1-ko-正常組、WT高脂組、MD1-ko-高脂組鼠的心肌組織培養(yǎng)72 h,加入裂解液裂解20 min,常規(guī)凝膠電泳,采用90 V電壓將蛋白轉印在NC膜上,5%的牛血清白蛋白封閉,加入一抗 TLR4、MyD88、P-CAMKII、CollagenI、CollagenIII和 TGF-β1(1∶500 稀釋),GAPDH(1∶1000 稀釋)作為參照,再加入二抗(1∶1000稀釋)過夜,滴加顯示液,采用Bio-Rad成像分析軟件進行掃描,GAPDH作為內參,分析 TLR4、MyD88、P-CAMKII、CollagenI、CollagenIII和TGF-β1蛋白水平。

1.3.3 HE染色

小鼠麻醉后,取左心室組織標本放在4%的多聚甲醛中固定24 h,石蠟包埋切片,切成4～5 mm的切片,55℃下烘烤30 min,二甲苯浸泡5 min,更換3次,分別放在無水乙醇、95%的乙醇、70%的乙醇中各1 min。蒸餾水1～2 min,濾紙上去掉水分,進行蘇木素染色5 min,清水沖洗,伊紅溶液5 min,二甲苯2 min,封片,應用Image-Pro Plus 6.0軟件測量細胞面積。

1.3.4 PSR染色

小鼠麻醉后,取左心室組織標本放在4%的多聚甲醛中固定24 h,石蠟包埋切片,切成4～5 mm的切片,55℃下烘烤30 min,二甲苯浸泡2 min,更換3次,別放在無水乙醇、95%的乙醇、70%的乙醇中各1 min,清水沖洗10 min,在放入雙蒸水和0.2%磷鋁酸中浸泡2 min,在放入0.1%天狼猩紅苦味酸溶液滴于染色組織上,置于濕盒中染色60 min,棄殘液,二甲苯2 min,封片,吹干,放于切片盒,顯微鏡觀察心肌組織纖維化的過程。

1.4 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據采用SPSS 21.0軟件處理,數(shù)據以平均數(shù)±標準差(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,并使用Fisher精確校驗,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠肥胖模型特征

小鼠經過20周的高脂飼料喂養(yǎng)后,WT高脂組中的體指數(shù)、血糖值、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、QTc間期、LVEDd、LVEDs、LVFS、LVEF明顯高于WT正常組(均P＜0.05);MD1-ko-高脂組中的體指數(shù)、血糖值、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、QTc間期、LVEDd、LVEDs、LVFS、LVEF明顯高于 WT高脂組(均P＜0.05),其他指標各組間比較無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表1。

2.2 MD1缺失增加了VA的易感性

WT高脂組動作點位時程(APD20、APD50、APD90)明顯高于WT正常組和MD1-ko-正常組(P＜0.05),MD1-ko-高脂組的動作點位時程(APD20、APD50、APD90)顯著高于 WT高脂組(P＜0.05);WT高脂組APD交替閾值明顯高于WT正常組和MD1-ko-正常組(P＜0.05),MD1-ko-高脂組APD交替閾值顯著高于WT高脂組(P＜0.05);WT高脂組VA比例明顯高于WT正常組和MD1-ko-正常組(P＜0.05),MD1-ko-高脂組VA比例顯著高于WT高脂組(P＜0.05),見圖 1。

2.3 MD1對TLR4/MyD88信號通路的影響

通過 Western blot檢測發(fā)現(xiàn),WT高脂組中TLR4、MyD88和P-CAMKII蛋白的表達明顯高于WT正常組和MD1-ko-正常組(均P＜0.05),MD1-ko-高脂組中 TLR4、MyD88和 P-CAMKII蛋白的表達明顯高于WT高脂組(均P＜0.05),見圖2。

2.4 MD1缺失激活TLR4/MyD88信號增加了小鼠心肌肥大

WT高脂組HW/BW比值(6.07±0.58)顯著高于WT正常組(4.35±0.38)和 MD1-ko-正常組(4.37±0.36)(均P＜0.05);MD1-ko-高脂組 HW/BW比值(7.59±0.78)明顯高于WT高脂組(P＜0.05)。WT高脂組小鼠心肌細胞橫截面積(190.15±25.23)μm2顯著高于 WT正常組(194.63±27.29)μm2和 MD1-ko-正常組(324.19±33.54)μm2(均P＜0.05);MD1-ko-高脂組小鼠心肌細胞橫截面積(381.23±35.76)μm2明顯高于 WT高脂組(P＜0.05)。HE染色發(fā)現(xiàn),WT高脂組和MD1-ko-高脂組較WT正常組、MD1-ko-正常組相比,肌絲排列混亂,心肌細胞體積明顯增大,細胞核深染,體積增大,見圖3。

2.5 MD1缺失激活TLR4/MyD88信號增加了小鼠心肌纖維化

經PSR染色發(fā)現(xiàn),WT正常組的組織間隙和血管周圍組織排列正常,未出現(xiàn)心肌纖維化和炎癥浸潤產生;MD1-ko-正常組的組織間隙和血管周圍組織有少量炎性細胞浸潤,組織排列正常;WT高脂組的組織間隙和血管周圍組織排列紊亂,心肌細胞出現(xiàn)少量壞死,心肌基本完整;MD1-ko-高脂組的組織間隙和血管周圍組織大量炎癥細胞浸潤,心肌纖維出現(xiàn)大部分斷裂,心肌細胞壞死嚴重,心肌纖維化產生。另外 WT高脂組的 CollagenI、CollagenIII和TGF-β1的蛋白明顯高于WT正常組和MD1-ko-正常組(均P＜0.05)MD1-ko-高脂組的 CollagenI、CollagenIII和TGF-β1的蛋白明顯高于WT高脂組(P＜0.05),見圖 4。

表1 小鼠肥胖的模型的基本特征Table 1 Basic characteristics of obesity model in mice

圖1 動作電位、APD的閾值和心率失常比例的表達Note.WTnormal,WTnormal group.MD1-ko-normal,MD1-ko-normal group.WThigh fat,WThigh fat group.MD1-ko-high fat,MD1-ko-high fat group.Compared with WT normal group,*P＜0.05.Compared with WT high fat group,#P＜0.05.The same as below.Figure 1 Expression of action potential,APD threshold and ratio of arrhythmia

圖2 TLR4、MyD88和P-CAMKII蛋白的表達Figure 2 Expression of TLR4,MyD88 and P-CAMKII proteins

圖3 HW/BW比值和小鼠心肌組織HE染色Figure 3 HW/BW ratio and he staining of mouse myocardium

圖4 組織間隙和血管周圍PSR染色和膠原纖維蛋白表達Note.WT normal,WT normal group.MD1-ko-normal,MD1-ko-normal group.wt high fat,WT high fat group.MD1-ko-high fat,MD1-kohigh fat group.Figure 4 PSR staining and collagen fibrin expression in interstitial and perivascular tissues

3 討論

本研主要新發(fā)現(xiàn)如下：首先,高脂飲食可引起代謝紊亂、左室舒張并延長QTc間期。其次,MD1的缺失的小鼠會增加高脂飲食誘導對VA的易感性,增強動作電位持續(xù)時間改變的閾值,使發(fā)病率大大提高。再次,MD1缺失可以激活TLR4/MyD88信號通路。最后是高脂飲食喂養(yǎng)后,MD1缺失激活TLR4/MyD88信號通路后,進一步加重了左室肥厚和纖維化。近年來,心血管疾病的持續(xù)增加,已經成為危害人類的主要疾病。所以出現(xiàn)肥胖,人們一定要提高警惕。本文主要研究了MD1的敲出后,高脂飲食對小鼠VA的影響。通過對MD1基因敲出小鼠和正常小鼠進行分組,分別進行高脂飲食和正常飲食,觀察小鼠的體指數(shù)、血糖值、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、QTc間期、LVEDd、LVEDs、LVFS、LVEF各項指標,發(fā)現(xiàn)被敲出了 MD1的小鼠上述指標均高于其他組的小鼠。說明MD1和小鼠的VA具有一定的相關性。大量的研究數(shù)據表明肥胖和心室復極有關,尤其使能夠延長QTc間期[6]。QTc間期延長是心肌不良重構的重要標志,它增加了心率失常的風險。

肥胖癥已成為一種流行病,是最普遍的疾病之一。大量證據表明肥胖與心室復極有關,特別是QTc間期延長[7]。QTc間期延長是異常電生理改變或不良電重構的標志,增加了VA的風險[8]。我們的研究發(fā)現(xiàn),WT高脂小鼠的QTc間期明顯增加,APD明顯延長,從而說明QTc間期和APD越長,VA發(fā)生率就越高。先前的一項研究也表明,高脂飲食可增加VA的誘發(fā)率,延長APD,提高APD的變化閾值[9]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn),WT高脂組動作點位時程APD明顯高于WT正常組和MD1-ko-正常組,APD改變閾值增加VA發(fā)生率增加,因此,我們認為MD1缺乏可能加重高脂喂養(yǎng)后的心率失常易感性。曾有研究證明,高脂喂養(yǎng)增加了心率失常的誘發(fā)性,延長了APD,提高了APD交替閾值[10]。前期也有研究證明,MD1基因敲出會加重小鼠的心房顫動的易感性[11],與我們研究的結果相似。因此,本研究驗證的MD1基因敲出的小鼠高脂喂養(yǎng)的會使心率失常的易感性進一步惡化。

臨床研究表明,肥胖相關的心臟肥大、左室舒張和心肌細胞肥大都是心臟猝死的重要病理表現(xiàn)[12],最近的研究也表明左室間質纖維化可顯著增加高脂肪喂養(yǎng)小鼠的心率失常誘導率[13]。在本研究中,高脂喂養(yǎng)可引起左室肥厚、纖維化、舒張,MD1缺失可加重這些效應。因此,MD1的丟失可能加重了高脂誘導的肥胖小鼠的左室肥厚和纖維化,從而促進了心室再通的形成,增加了心率失常的脆弱性。

MD1調控心肌重構的潛在機制可能與TLR4/MyD88信號通路相關,既往研究表明,TLR4的激活可正常維持MyD88信號的激活,TLR4使高血脂癥狀態(tài)下心臟P-CAMKII的上有信號,P-CAMKII對心臟的重構也非常重要[14]。本研究發(fā)現(xiàn),喂養(yǎng)高脂食物后,WT高脂組中TLR4、MyD88和P-CAMKII蛋白的表達明顯升高,MD1-ko-高脂組中TLR4、MyD88和P-CAMKII蛋白的表達也明顯增加。所以說明MD1敲出會導致信號通路TLR4/MyD88更明顯的表達,進一步加劇了慢性壓力超負荷的心臟重構能力。促進了心率失常的風險。臨床研究表明,肥胖于心臟肥大、左心室擴張、心肌細胞肥大具有一定的相關性[15]。最近一項研究表明,左心室間質纖維化的小鼠增加高脂喂養(yǎng),可誘導VA的發(fā)生[16]。本研究中高脂喂養(yǎng),WT高脂的小鼠HW/BW比值和橫截面積升高;說明MD1基因敲出后,加重了心肌細胞的肥大,提高了VA的易感性。Cao等[17]人研究表明MD1基因敲出焦距了左室肥厚和纖維化,從而促進心室在形成,增加了高脂誘導肥胖小鼠VA的易感性。

綜合上述,MD1缺乏增加了高脂飲食誘導的VA易感性,主要原因是由于TLR4/MyD88信號通路的激活增強,導致左心室的肥厚和纖維化,降低了離心通道蛋白的表達。