降壓物質檢查試驗中家貓對組胺靈敏度分析

黃甘泉吳賢生王鳳姬姚嘉琪黃 銳梁冠澤嚴家榮鄺少松

(廣東省醫學實驗動物中心,佛山 528248)

貓在生理及醫藥學上的研究使用,最早可追溯到19世紀末[1]。貓的循環系統發達,血壓穩定,對強心苷和組胺較敏感,并且可以迅速代謝組胺等生物,適用于藥物篩選與降壓物質檢查試驗[2]。因此在中國藥典、歐洲藥典和英國藥典收錄的降壓物質檢查法中,貓都是方法指定的實驗動物。受困于國內貓的實驗動物化進展緩慢,我們很難通過市場購買途徑獲得具有實驗動物質量合格證明的實驗貓。目前用于藥品檢測的實驗用貓仍以農戶飼養家貓、寵物貓和流浪貓為主。這些貓遺傳背景、年齡、健康狀態、攜帶病原生物不明,體重差異較大,均可能影響到實驗結果的準確性。

劉明慧等[3]推測中國每年用于實驗的貓的數量達5000只,但其背景數據等少見報道。本研究中,本研究統計了近年來本單位用于降壓物質檢查的404只實驗用貓的血壓值和其對組胺的靈敏度,為今后降壓物質檢查試驗或其他以貓作為實驗系統的心血管方面試驗提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

成年雄性家貓404只,體重2.5～4.5 kg,均購于廣東省廣州市周邊農村。動物實驗在廣東省醫學實驗動物中心[SYXK(粵)2018-0002]開展。實驗動物倫理由廣東省醫學實驗動物中心倫理委員會審批,倫理審批號：A201501-3、A201601-18、A201701-17、A201801-24、A201901-13。 本實驗涉及的與動物實驗相關的內容和程序遵從實驗動物使用和管理的相關法律法規及本機構實驗動物倫理委員會的相關規定,遵循動物使用的“3R”原則,給予動物人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

BL-420S生物機能儀,成都泰盟科技有限公司;電子天平,上海蒲春計量儀器有限公司;磷酸組胺標準品,中國食品藥品檢定研究院;肝素鈉注射液,成都市海通藥業有限公司;鹽酸賽拉嗪注射液,吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司;戊巴比妥鈉,美國Sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物麻醉

通過肌肉注射鹽酸塞拉嗪注射液0.1 mL/kg和耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液10 mg/kg體重聯合麻醉[4],需要用于2批次及2批次以上樣品降壓物質檢查的家貓,在完成第一輪降壓物質檢查試驗后(約1 h),皮下注射戊巴比妥鈉進行補充麻醉,補充麻醉劑量為3 mg/kg體重。

1.3.2 血壓測量

家貓麻醉后分離一側頸動脈并連接生物機能儀進行血壓測定,分離一側股靜脈用于組胺對照品和樣品的注射。按照《中國藥典》降壓物質檢查法的要求,每批次樣品檢查前按家貓體重每1 kg注射組胺0.05 μg、0.10 μg、0.15 μg,重復 2次,取 2次同劑量組胺引起的血壓反應的均值作為該使用次數的反應值。相鄰2次注射的間隔時間盡量保持一致,每2次靈敏度檢查的重復時間間隔為 50～55 min。

1.3.3 數據整理和分析

比較和分析家貓體重對基礎血壓值和首次使用組胺靈敏度的影響,基礎血壓值對組胺靈敏度的影響。比較不同使用次數家貓的血壓值和靈敏度,分析重復使用次數對家貓血壓值和組胺靈敏度的影響。

1.4 統計學方法

應用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析,數據以平均數±標準差(±s)表示。組間比較采用單因素方差分析,方差不齊時采用非參數檢驗進行分析,P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 家貓體重與血壓基礎值

本研究共統計了404只雄性家貓麻醉狀態下的頸動脈基礎血壓值,這些家貓平均體重為3.41 kg,平均頸動脈收縮壓、舒張壓和平均壓分別為：(18.10±3.69)kPa、(13.32±2.88)kPa和(14.91±3.10)kPa。將家貓按照體重大小劃分,分別統計其體重和基礎血壓值的關系,其結果如表1所示,不同體重的家貓血壓均未見明顯差異(P＞ 0.05)。

2.2 家貓體重和對組胺的靈敏度

本研究所統計的404只家貓對0.05μg/kg、0.10μg/kg和0.15μg/kg組胺所致血壓反應值分別為(3.25±1.11)kPa、(4.72±1.31)kPa和(5.38±1.45)kPa。如表2所示,不同體重的家貓對3個劑量的組胺靈敏度均未見明顯差異(P＞0.05)。

2.3 基礎血壓值對靈敏度和使用次數的影響

如圖1所示,0.05μg/kg、0.10μg/kg和 0.15 μg/kg劑量的組胺所致家貓血壓反應值和家貓的基礎血壓值均成正相關(P＜0.05)。相同劑量的組胺,在基礎血壓值較高的家貓身上會引起更大的降壓作用,可認為基礎血壓值高的家貓對組胺引起的血壓降低作用更為敏感。

如表3所示,將家貓基礎血壓值按2 kPa幅度劃分區間,家貓對組胺所致的血壓反應值隨基礎血壓升高而增大。家貓基礎血壓值低于12 kPa時,平均用于檢測藥品降壓物質的次數為4.11次。14～16 kPa基礎血壓值范圍的家貓可重復使用次數最高,達到5.04次,顯著高于＜12 kPa范圍的家貓(P＜0.05)。基礎血壓值高于16 kPa后,家貓的可重復使用次數減少。

2.4 重復使用次數對家貓血壓值和靈敏度的影響

如表4所示,家貓重復用于降壓物質檢查,前6次使用時的基礎血壓值未見明顯下降。與首次使用血壓基礎值比較,重復使用第7次和第8次時家貓血壓基礎值顯著下降(P＜0.05)。

前6次使用時,隨著使用次數增加,低劑量組胺引起家貓的血壓反應值逐漸減小,中劑量所致反應值未見明顯波動,高劑量所致反應值升高。與初次使用比較,第4～6次低劑量組胺所致反應值明顯降低(P＜0.05),第3次和第4次高劑量所致反應值明顯升高(P＜0.05)。

表1 家貓體重對基礎血壓值的影響(♂)Table 1 Influence of body weight on blood pressure of domestic cats

表2 家貓體重對組胺靈敏度比較(♂)Table 2 Influence of body weight on sensitivity for histamine of domestic cats

圖1 家貓血壓值與不同劑量組胺靈敏度相關性分析Figure 1 Correlation analysis of sensitivities for different dosage of histamine and blood pressure of domestic cats

與首次使用比較,第7次重復使用時家貓基礎血壓值和低劑量組胺所致反應值均顯著下降(P＜0.05),中劑量和高劑量所致反應值小幅下降(P＞0.05)。第8次重復使用時,家貓基礎血壓值和低、中、高劑量組胺所致血壓反應值均顯著下降(P＜0.05)。

3 討論

藥品在生產制造過程中,可能會混入使血管擴張而降低血壓的活性物質(包括組胺、緩激肽等組胺類物質),中藥中也含有大量降低血壓的未知和已知雜質成分。靜脈注射該類藥品有急性降血壓作用,有可能誘發嚴重的心血管系統不良反應[5]。目前《中國人民共和國藥典》2015年版收錄的檢測引起血壓下降物質的方法主要降壓物質檢查法和組胺類物質檢查法,有研究報道,組胺類物質檢查結果不可直接外推至整體實驗[6-7]。因此降壓物質檢查法仍是當前最主要的檢測藥物制劑降壓物質的檢測方法。

根據《中國人民共和國藥典》2015年版規定,降壓物質檢查使用家貓進行,雌雄均可,雌性動物應無孕[8]。因無法購買到質量可靠的標準化實驗貓,在開展降壓物質檢查活動時我們僅能從廣州附近收購農戶的家貓,并且僅能在麻醉后才能夠仔細檢查家貓是否無孕,出于動物倫理和保證實驗質量的考慮,我們僅選擇使用雄性家貓進行實。

在進行麻醉時,鹽酸塞拉嗪作為肌松劑,主要作用是使家貓肌肉松弛,以便靜注戊巴比妥鈉,聯合麻醉可以降低戊巴比妥鈉的使用劑量,減少麻醉風險,達到良好的麻醉效果[9]。聯合麻醉的維持時間約為2 h,同一只貓如需進行多批受試樣品的降壓物質檢查,在完成第一批受試樣品降壓物質檢查后皮下注射戊巴比妥鈉溶液補充麻醉[10]。與肌注或者靜注給藥方式補充麻醉相比,皮下注射補充麻醉的方式因吸收緩慢,可以避免快速補充麻醉劑而導致貓血壓的下降,從而減少補充麻醉對檢測結果的影響。同時應密切關注貓的麻醉狀態,不同的麻醉深度對血壓有影響,本研究中通過觀察麻醉家貓呼吸,黏膜顏色和基礎血壓值等適當補充麻醉,盡可能使得家貓處于麻醉三期(外科麻醉期)以減少不同麻醉深度對血壓的影響。例如麻醉家貓出現呼吸不規則、基礎血壓升高、掙扎等癥狀,說明麻醉過淺,應該補充麻醉;例如呼吸減慢,出現呼吸抑制或基礎血壓下降等癥狀,說明麻醉過深,應注射麻醉解藥(腎上腺素)[11]。

表3 血壓對家貓組胺靈敏度和重復使用次數的影響(♂)Table 3 Influence of blood pressure on sensitivity for histamine and reuse capability of domestic cats

表4 重復使用次數對家貓靈敏度影響(♂)Table 4 Influence of reuse time on sensitivity for histamin of domestic cats

本研究中我們共統計了2015～2019年間我單位使用的貓家的血壓數據,在尚無標準化實驗貓可供使用的情況下,這些數據應有較大參考意義。通過比較不同體重范圍家貓的血壓基礎值和其對組胺的靈敏度,尋找適合實驗的家貓體重范圍。實驗結果表明,雖然家貓的體重差異較大,但基礎血壓值和對組胺的靈敏度均很穩定,不受體重的影響。麻醉后的基礎血壓值對家貓的可重復使用次數較為相關,基礎血壓值在16～18 kPa范圍的家貓可重復使用次數最多。影響家貓的基礎血壓值的因素包括遺傳背景、個體差異、健康狀態、麻醉劑選擇與麻醉深度等。在進行降壓物質檢查試驗時,選擇健康狀態良好的實驗動物和適合的麻醉方法,可增加每只家貓用于樣品檢測的次數,從而減少家貓的使用。

《中國藥典》對降壓物質檢查中家貓對組胺靈敏度的要求是中劑量組胺(0.01μg/kg)所致反應值不低于2.67 kPa,同時各劑量所致反應值有差別。本次研究中,家貓每次重復使用間隔均為1 h左右,在前6次重復使用過程中,家貓的血壓值和對中劑量組胺的靈敏度均未見明顯變化,并且重復使用后家貓對不同劑量的組胺所致反應值差別增大,其增大的原因仍未清楚。第7、8次重復使用時,血壓值出現較明顯降低,對組胺的靈敏度也逐漸減小,但仍滿足《中國藥典》對靈敏度的要求。因為實驗時間以及工作安排方面的原因,我們未進行更多重復使用次數的實驗。

目前國內用于降壓物質檢查的家貓多為非標準化實驗動物,其個體差異不可控制,健康狀況無法保證,同時因這些家貓常常攜帶寄生蟲和微生物,對實驗結果以及實驗人員的安全均產生威脅和影響[12-13]。雖偶有標準化實驗貓建立的文獻報道,卻未見推廣和銷售[3]。以此,建立實驗貓的繁殖、培育和檢驗相關標準以及標準化實驗動物仍需持續推進。