多管發酵法與濾膜法測定水中糞大腸菌群的對比研究

王朝霞

摘 要：多管發酵法和濾膜法是我國現有的環境標準分析方法體系中主要的糞大腸菌群檢測方法。本文通過使用IDEXX公司提供的32份糞大腸菌群質控標樣進行比對檢測，了解2種方法的吻合度，并通過分析檢測過程中的各種影響因素和方法優缺點，以判斷2種方法更適合的水質檢測。

關鍵詞：多管發酵法;濾膜法;影響因素;優缺點

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

糞大腸菌群是在44.5℃條件下能發酵乳糖產酸產氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌[1]。糞大腸菌群的監測是相關環保標準和環保工作的需要。我國有9個標準中規定了濃度限值和排放限值。在我國，多管發酵法是各級環境監測部門普遍采用的經典方法，我國現有的環境標準分析方法體系中，糞大腸菌群的主要檢測方法為多管發酵法和濾膜法。本研究旨在將2種方法進行對比，了解2種方法的吻合度和優缺點。

1 實驗部分

1.1 實驗原理

1.1.1 多管發酵法[2]

將樣品加入含乳糖蛋白胨培養基的試管中，37℃初發酵富集培養，大腸菌群在培養基中生長繁殖分解乳糖產酸產氣，產生的酸使溴甲酚紫指示劑由紫色變為黃色，產生的氣體進入倒管中，指示產氣。44.5℃復發酵培養，培養基中的膽鹽3號可抑制革蘭氏陽性菌的生長，最后產氣的細菌確定為糞大腸菌群。通過查MPN表，得出糞大腸菌群濃度值。

1.1.2 濾膜法[3]

樣品通過孔徑為0.45μm的濾膜過濾，細菌被截留在濾膜上，然后將濾膜置于MFC選擇性培養基上，在特定的溫度（44.5℃）下培養24h，膽鹽3號可抑制革蘭氏陽性菌的生長，糞大腸菌群能生長并發酵乳糖產酸使指示劑變色，通過顏色判斷是否產酸，并通過呈藍色或藍綠色菌落計數，測定樣品中糞大腸菌群濃度。

1.2 水樣的采集

距水面約10～15cm處采樣，采集樣品盛裝于滅菌的采樣瓶中。

1.3 試劑

1.3.1 多管發酵法

單倍乳糖蛋白胨培養基、3倍乳糖蛋白胨培養基、EC培養基。

1.3.2 濾膜法

MFC培養基。

1.4 實驗步驟

1.4.1 多管發酵法

根據水樣污染程度，確定水樣接種量。將水樣接種到乳糖蛋白胨試管中，在37±0.5℃下培養24±2h進行初發酵。輕微振蕩在初發酵試驗中產酸產氣或只產酸未產氣的試管，用火焰灼燒滅菌冷卻后的接種環，將培養物分別轉接到裝有EC培養基的試管中，在44.5±0.5℃下培養24±2h。培養后立即觀察，導管中產氣證實為糞大腸菌群陽性。根據陽性管數查MPN表換算樣品中糞大腸菌群數。

1.4.2 濾膜法

先估計出適合在濾膜上計數所使用的體積，然后再取這個體積的1/10和10倍，分別過濾。根據樣品的種類判斷接種量，最小過濾體積為10mL，若接種量<10mL時應逐級稀釋。將樣品充分混勻后抽濾，以無菌水沖洗器壁2～3次。用滅菌鑷子夾取濾膜移放在MFC培養基上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應與培養基完全貼緊，將培養皿倒置，放入恒溫培養箱內，44.5±0.5℃培養24±2h。計數陽性菌落。

2 實驗結果與討論

2.1 水樣檢測結果

使用IDEXX公司提供的糞大腸菌群質控標樣，對濾膜法和多管發酵法進行方法質控，檢測的結果見表1。由表1可知，濾膜法和多管發酵法的檢測結果均在質量控制可信度區間內。但濾膜法測定的結果要略低于多管發酵法測定的結果。

2.2 實驗過程的影響因素

濾膜法受濾膜孔徑的影響，不能檢測濁度大、非大腸桿菌類細菌密度大的水樣。對于濁度大或污染嚴重的樣品，需先稀釋后再抽濾，但稀釋度越大，誤差越大[4];濾膜法每輪抽濾結束后，要對抽濾設備充分滅菌，否則會影響后面樣品的檢測結果。

多管發酵法初發酵時，因單倍乳糖蛋白胨培養基中的接種量僅為1mL，在樣品濃度比較低的情況下，易出現陽性結果不明顯的發酵管，需認真觀察，將疑似陽性的初發酵管也轉接進行復發酵;多管發酵法培養基分裝滅菌時，發酵管內倒管中的氣泡一定要排盡，否則會在發酵結束后的判定時出現假陽性結果;多管發酵法吸取不同濃度的稀釋液時，每次必須更換移液管，否則會造成檢測結果的不準確。

2.3 方法的優缺點

多管發酵法是糞大腸菌群檢測的經典方法，可用于檢測各種水樣，其它方法的研究都是與多管發酵法進行準確度和可靠性的比較，但其操作步驟繁瑣，檢測周期長，培養基保存時間短，工作量大，干擾因素多，需要消耗大量的人力和物力的缺點，已經不能滿足當前國內外的檢測需求。

濾膜法可檢測體積較大的水樣，操作簡單，一次到位，避免操作過程中的二次污染，但稀釋度越大，誤差越大。受孔徑影響，不能檢測濁度大、非大腸桿菌類細菌密度大的水樣。

3 結論

本實驗使用IDEXX公司提供的32份糞大腸菌群質控標樣，分別用濾膜法和多管發酵法進行檢測，檢測結果均在質量控制可信度區間內，濾膜法測定的結果要略低于多管發酵法測定的結果。濾膜法操作簡單，一次到位，適合于比較清潔的水質;而多管發酵法可適用于各種水質。

參考文獻

[1]?張少峰，劉國強，魏春雷.糞大腸菌群檢測方法及研究進展[J].海洋通報，2008（03）：102-106.

[2]HJ347.2-2018，水質 糞大腸菌群的測定 多管發酵法[S].

[3]HJ 347.1-2018，水質 糞大腸菌群的測定 濾膜法[S].

[4]戴巧容，劉育，李燕.多管發酵法與濾膜法測定水中糞大腸菌群的探討[J].科技創業家， 2012（13）：213.

（責任編輯 周康）