臭茉莉葉總黃酮提取工藝優化及月周期變化研究

喻錄容，宋小云，何先元，，黃 鶴，歐陽凱，黃英如

（1.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 401331；2.中醫藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶 400016）

臭茉莉來源為馬鞭草科大青屬植物臭茉莉Clerodendron fragrans Vent.以根、葉入藥，全年可采，切制，曬干或者鮮用，性平，味苦，有祛風利濕、化痰止咳、活血消腫的功效。根可以治療風濕性關節炎、腳氣水腫、白帶、支氣管炎等，葉多外用治療濕疹、皮膚搔癢等。全草中含有黃酮苷、酚類、皂苷、鞣質、黃酮類化合物［1-2］。黃酮類廣泛存在于植物界，具有抗炎癥、抗過敏、抑制細菌真菌病毒繁殖和寄生蟲生長、防治肝病及心腦血管疾病、抗腫瘤等作用。我們對臭茉莉葉總黃酮提取工藝，1年內月周期變化規律［3-9］進行了研究，以期為臭茉莉最佳采收期提供經濟效益的理論參考。

1 材 料

儀器。UV-1800型紫外分光光度計（日本島津公司），FW177型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司），TG328B型分析天平（上海精科天平儀器廠），藥典篩（浙江上虞市五四儀器廠），SB-5200DT超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份公司，200W），HH-S4數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠），SHB-Ⅲ型循環水真空泵（鞏義市英峪華中儀器廠），RE-52旋轉蒸發儀器（上海亞榮生化儀器廠）。

試藥。藥材采自重慶市重慶醫科大學植物園（經生藥學費曜副教授鑒定為臭茉莉Clerodendron fragrans Vent.），3月15日采集的主要是頂芽，4～10月每月的15日采集頂芽后3～6位葉，去除雜質，立即烘箱60℃烘干，打成粉末過4號藥典篩備用，以下粉末均同一處理方式。蘆丁標準品（UV≥98%，批號130507，北京德威鈉生物技術有限公司）。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉和無水乙醇均為分析純。

2 方法與結果

2.1 檢測方法建立

對照品溶液：精密稱取105 ℃下烘干至恒重的蘆丁標準品0.0200 g，置50mL量瓶中，加70 %的乙醇溶液，超聲處理（功率：200W，頻率：20kHz），振搖溶解，然后配成濃度為4.0mg·mL-1的蘆丁標準液M和0.4mg·mL-1的蘆丁標準液N。

實驗樣品溶液：精密稱取每個月份（3、4、5、6、7、8、9、10月份）的臭茉莉葉粉末（過4號藥典篩）1g左右分別于50mL錐形瓶，每個錐形瓶均精密加入20mL的70%乙醇，在60℃條件下超聲（200W，40kHz）30min，提取2次，抽濾，合并濾液，恒溫水浴下蒸干，殘存物用70%乙醇溶解，然后至50mL容量瓶定容，即一年內8個月份臭茉莉葉實驗樣品溶液。

溶液的顯色：精密移取8個月份的臭茉莉葉實驗樣品溶液各1.0 mL，均加入5 %亞硝酸鈉溶液0.5 mL，振搖均勻，靜置6min后，加入10 %硝酸鋁溶液0.5mL，搖勻后再靜置6min，接著加入4%氫氧化鈉溶液5mL，靜置15min后，即為8個月份實驗樣品溶液顯色結果。

檢測波長的確定：精密量取實驗樣品溶液和蘆丁標準液N各1mL，以70%乙醇溶液為空白對照組，顯色后在400～700nm波長范圍內進行掃描，兩者共有的最大吸收波長即為檢測波長。蘆丁標準品溶液和臭茉莉葉實驗樣品溶液在508nm處均為最大吸收波長，故確定508nm為實驗檢測波長。

2.2 標準曲線的繪制

精密量取蘆丁標準品B 0.0，0.1，0.2，0.5，1.0mL，蘆丁標準液M0.2，0.4mL，分別置于15mL具塞試管中，靜置6min，用0mL試管做空白對照組，用紫外分光光度計，選擇在508nm波長處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，以標準品溶液濃度為橫坐標（mg·mL-1），繪制標準曲線。得到線性回歸方程：A=1.7983C-0.02129（r=0.99934），結果表明，蘆丁對照品質量濃度在0.04～1.60mg·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.3 臭茉莉葉總黃酮提取率的計算

精密吸取臭茉莉葉實驗樣品溶液1.0mL，顯色完成后，即刻測定其吸光度，由標準曲線所得的回歸方程計算出實驗樣品溶液中總黃酮含量，以便計算出臭茉莉葉中總黃酮的提取率。

總黃酮提取率=實驗樣品液中總黃酮含量/臭茉莉葉質量×100%。

2.4 單因素實驗

乙醇濃度對臭茉莉葉總黃酮提取的影響。固定料液比為1∶20（g·mL-1），溫度為30℃，然后選擇不同的乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%等條件下提取3次，每次30min，比較總黃酮含量，預測正交試驗將要采用乙醇提取濃度范圍。結果隨著乙醇濃度增加后，臭茉莉葉總黃酮的提取率呈現出先升高后降低的變化趨勢，在乙醇濃度為60%時，總黃酮提取率達到最高。見圖1-A。

超聲時間對臭茉莉葉總黃酮提取的影響。固定70%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20g·mL-1，溫度為30℃，選擇不同的超聲時間為25min、30min、35min、40min、45min等條件下提取3次，比較總黃酮含量，預測正交試驗將采用的超聲時間范圍。結果顯示隨著超聲提取時間的延長，臭茉莉葉總黃酮的提取率呈現先升高后降低的變化趨勢，其中在超聲提取時間為50 min時，總黃酮提取率達到最高。見圖1-B。

料液比對臭茉莉葉總黃酮提取的影響。固定70 %乙醇為提取溶劑，溫度為30 ℃，時間為每次30min，選擇不同的料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g·mL-1）等條件下提取3次，測定比較總黃酮含量，預測正交試驗將要采用的料液比范圍。結果顯示隨著料液比提高，臭茉莉葉總黃酮的提取率呈現先升高后降低的變化趨勢，其中在料液比為1∶25（g·mL-1）時，臭茉莉葉總黃酮提取率達到最高。見圖1-C。

提取溫度對臭茉莉葉總黃酮提取的影響。固定70%乙醇為提取溶劑，料液比為1∶20g·mL-1，時間為30min，在不同的提取溫度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃等條件下分別提取3次，測定比較總黃酮含量，預測正交試驗將采用的提取溫度范圍。結果顯示隨著溫度增高，臭茉莉葉總黃酮的提取率呈現先升高后降低的變化趨勢，在溫度為50 ℃時臭茉莉葉總黃酮提取率最高。見圖1-D。

圖1 乙醇濃度（A）、超聲時間（B）、料液比（C）及提取溫度（D）對臭茉莉總黃酮提取的影響

2.5 正交試驗設計優選臭茉莉葉總黃酮提取最優工藝

綜合前面單因素實驗結果，在此基礎上設計L9（34）正交實驗，進一步研究乙醇濃度（A）、超聲時間（B）、料液比（C）、提取溫度（D）對臭茉莉葉總黃酮提取率的影響，正交試驗因素與水平見表1，正交實驗設計及結果見表2。

表1 L9（34）正交實驗因素與水平表

表2 L9（34）正交實驗結果

由表2可知，對臭茉莉葉總黃酮提取率的影響，由大到小排列依次是乙醇濃度＞料液比＞超聲時間＞提取溫度。總黃酮最佳提取工藝組合是A2B3C2D2，即乙醇濃度為60%，超聲提取時間為60min，料液比為1∶25（g·mL-1），提取溫度為50℃，按這個工藝提取的臭茉莉葉總黃酮含量最高。

2.6 臭茉莉葉總黃酮最優提取工藝穩定性試驗

精確稱定臭茉莉葉粉末1.0000g，按照最優提取工藝流程進行操作提取，顯色完成后，立即測定溶液吸光度，然后，每間隔30min測一次溶液吸光度，考察4h內總黃酮的穩定性。結果臭茉莉葉總黃酮吸光度結果的RSD（n=9）值為0.95%，說明在4h內，黃酮標準品和臭茉莉葉總黃酮采用本文的提取方法和顯色方法都比較穩定。

2.7 臭茉莉葉總黃酮最優提取工藝驗證性實驗

準確稱取臭茉莉葉粉末10.0000g，3份，按照最優提取工藝進行提取操作，顯色完成后，立即測定溶液吸光度，計算臭茉莉葉總黃酮平均提取率和含量。結果臭茉莉葉總黃酮平均提取率為5.18%，RSD=2.17%（n=3）。臭茉莉葉總黃酮含量為5.18mg·g-1。與正交試驗結果基本一致，表明最優工藝合理可行。

2.8 臭茉莉葉總黃酮最優提取精密度實驗

精密吸取蘆丁對照品溶液1 mL，置于15 mL具塞試管中，按“2.1”方法顯色并制備空白溶液后在508nm波長處測定吸光度，平行操作5次。結果，RSD＝0.27%（n=5），表明儀器精密度良好。

2.9 臭茉莉葉3-10月份總黃酮含量測定結果

采用正交實驗優選的最優工藝條件，提取測定臭茉莉3～10等8個月份總黃酮，從圖E可以看出，臭茉莉總黃酮代謝變化呈現出“高-低-高-低-高-低”的趨勢。3月份總黃酮含量最高，總黃酮/藥材量達0.0235mg·g-1，也就是臭茉莉剛剛長出嫩芽時就總黃酮含量最高；其次是5月的0.0194 mg·g-1和7月的0.0182 mg·g-1，3月份總黃酮含量最高，出現這種情況的可能原因是經歷了一個冬天的休眠，春季剛開始進行旺盛的生命活動，代謝轉化產生了黃酮，盡管總黃酮含量最高，但剛發的芽葉片比較小，經濟產量還是比較低；5月份和7月份總黃酮含量比較高，此時枝繁葉茂，葉片經濟產量比較高，適合采收；到了8～10月，植物葉片產量增加不大，黃酮含量減少，經濟產量比較低，經濟效益就低。黃酮屬于植物新陳代謝的次生產物，總黃酮含量變化符合植物生長大周期規律。

圖E 臭茉莉葉3-10月份總黃酮含量變化趨勢

3 討 論

提取工藝簡單可行。通過單因素實驗和正交實驗，優選出提取總黃酮的最優工藝，即乙醇濃度為70%，超聲時間為60min，料液比為1∶25（g·mL-1），提取溫度為50℃，提高臭茉莉葉總黃酮提取率。4個因素對臭茉莉葉總黃酮提取率影響的大小一次是提取溶劑濃度＞料液比＞超聲時間＞提取溫度，因此提取過程中一定要嚴格把控提取溶劑濃度，它對總黃酮的提取率有顯著影響，在一定范圍內，臭茉莉葉總黃酮提取率會隨著溶劑濃度升高而增大。

總黃酮含量呈周期變化。臭茉莉葉總黃酮一年內月周期變化基本符合植物葉片生長大周期規律，與植物生長代謝基本一致，當葉片生長快時，總黃酮含量低；當葉片生長慢時，總黃酮含量高；植物葉片不生長時，總黃酮含量下降［10］。

經濟效益使用價值最高時采收。從總黃酮含量，盡管3月份含量最高，但是葉片產量最低，總黃酮使用價值僅從體外抗氧化活性分析［11］，臭茉莉葉總黃酮對DPPH自由基清除率6月份達最高，總黃酮對ABTS自由基的清除能力5月份和7月份出現兩個峰值，所以，結合葉片產量、總黃酮含量和體外抗氧化效應等綜合因素來考慮，5月份和7月份作為采收最佳時節。