依那普利對腎間質纖維化大鼠模型的治療作用研究

邢詒喜，陳維飛，姚奇岑，林千祺，梁 金，黃美瓊，張瑞城

0 引言

腎臟間質纖維化是慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)發展至終末期腎病的必經之路，阻止腎臟間質纖維化即是保護腎功能、防治慢性腎病的主要藥物治療靶點[1]。依那普利(Enalapril)是臨床上常用的血管緊張素轉換酶抑制劑(Angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)[2]，主要用于高血壓、心力衰竭的治療[3]，臨床應用中發現，ACEI藥物具有腎保護作用[4]。本研究應用單側輸尿管梗阻(Unilateral urethral obstruction，UUO)大鼠模型探討依那普利對腎臟間質纖維化的抑制作用，并探討其相關機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 依那普利片為江蘇揚子江制藥公司產品(批號：18102455)，水合氯醛鈉為美國Sigma公司產品(批號：1810023313)，P65、TGF-β1、Smad3、Histone、β-actin抗體以及辣根過氧化物酶標記二抗購自美國Abcam公司(貨號：ab30186、ab22174、ab02871、ab30185、ab20117)，Masson 染色試劑盒購自美國Solarbio公司(批號：20180914)，奧林巴斯顯微鏡為日本Olympus公司產品(BX53MRF-S)，雙垂直(DYCZ-25D)和轉印電泳儀(DYCZ-40G)為北京市六一儀器廠產品。

1.2 實驗動物 60只清潔級SD雄性大鼠購自海南醫學院動物實驗中心，6～8周齡，體重180～210 g，清潔級環境下適應性飼養3 d后，進行UUO模型制作。

1.3 實驗造模、給藥 參考本課題組的方法構建UUO大鼠模型[5]，簡述如下：使用數值表法將60只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、低劑量[10 mg/(kg·d)]依那普利組(低劑量組)和高劑量[20 mg/(kg·d)]依那普利組(高劑量組)，每組15只。60只SD大鼠給予10%水合氯醛鈉腹腔注射麻醉，假手術組暴露腎臟并分離出左側輸尿管后不結扎，關腹，縫合皮膚切口，模型組、依那普利組用4 號無菌絲線雙重結扎左側輸尿管，關腹，縫合皮膚切口。假手術組和模型組每天給等量生理鹽水灌胃，依那普利組給予相應劑量依那普利灌胃，持續14 d。

1.4 腎組織的HE和Masson染色 14 d后，斷頸處死各組大鼠，取出患側腎臟組織送我院病理科制作石蠟切片，常規HE染色，200×光鏡下選取 10 個視野(左上、左下、右上、右下、中間各2個)計算腎小管損傷評分，腎小管上皮細胞空泡變性、萎縮、壞死<10% 1分、<25% 2分、<50% 3分、<75% 4分、≥75% 5分。Masson 染色嚴格按照試劑盒說明書操作，Image 多媒體彩色病理圖像分析軟件采集圖像，計算Masson 染色陽性面積占整個視野面積的百分比，計算腎間質纖維化評分，百分比<10% 1分，<25% 2分、<50% 3分、<75% 4分、≥75% 5分。

1.5 Western blot檢測 14 d后，斷頸處死各組大鼠，取出50 mg患側腎臟組織，液氮下研磨，加入蛋白裂解液，混勻后，100 ℃水浴20 min，蛋白定量后每份樣品取10 μg總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白電轉移至PVDF膜，1∶1 000稀釋入P65、TGF-β1、Smad3、Histone、β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，加入二抗，使用堿性磷酸酯酶顯色后，曝光目的條帶。Bandscan 5.0軟件掃描各條帶，對照內參histone和β-actin計算各目的條帶的相對灰度值。

1.6 統計學處理 應用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，兩組均數間比較采用t檢驗，多組均數間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎臟的組織病理學改變 從圖1可見，假手術組腎組織結構正常，模型組、依那普利組腎小球萎縮，腎小管擴張，上皮細胞空泡變性、壞死，可見蛋白管型，間質炎性細胞浸潤。假手術組、模型組、低劑量組和高劑量組腎小管損傷評分分別為0.12±0.02、4.12±0.61、3.11±0.34、2.47±0.26，四組間比較差異有統計學意義(F=10.81，P<0.01)，其中依那普利組腎小管損傷評分顯著低于模型組(P<0.01)，高劑量組顯著低于低劑量組(P<0.01)。

2.2 腎臟間質的Masson 染色結果分析 從圖2可見，模型組間質纖維顯著增多，依那普利組間質纖維顯著減少。假手術組、模型組、低劑量組和高劑量組腎間質纖維化評分分別為0.26±0.05、3.64±0.53、2.48±0.36、1.83±0.22，四組間差異有統計學意義(F=11.317，P<0.01)，其中，依那普利組腎間質纖維化評分顯著低于模型組(P<0.01)，高劑量組低于低劑量組(P<0.01)。

圖1 四組腎組織HE染色(200×)

圖2 四組腎間質Masson染色(200×)

2.3 依那普利對NF-κB/TGF-β1/Smad3通路的影響 從表1可見，四組P65、TGF-β1和Smad3蛋白相對灰度值比較差異有統計學意義(P<0.01)，其中依那普利組P65、TGF-β1和Smad3蛋白相對灰度值顯著低于模型組(P<0.01)，高劑量組顯著低于低劑量組(P<0.01)。圖3顯示了相應蛋白表達的變化。

表1 四組P65、TGF-β1和Smad3蛋白相對灰度值比較

圖3 蛋白的Western blot檢測

3 討論

腎纖維化是CKD疾病慢性進展的主要病理變化，延緩腎間質纖維化成為CKD疾病治療首要考慮的問題[6]。臨床使用中發現，ACEI抑制劑使用者腎間質纖維化指標優于未使用者[7]，但對其作用機制未做深入研究，楊慧等[8]研究發現，依那普利可以阻止腎間質纖維化模型大鼠的腎小管上皮細胞凋亡，腎小管上皮細胞既是慢性炎癥的受害者，同時受損的上皮細胞也可以分泌細胞因子參與到炎癥中，保護上皮細胞，阻止炎癥的級聯放大[9]。本研究通過構建UUO大鼠模型，發現依那普利組腎小管損傷評分顯著低于模型組，也說明依那普利對腎小管上皮細胞發揮保護作用，Masson染色分析依那普利組腎間質纖維化評分顯著低于模型組，也說明依那普利可以抑制腎間質纖維化進程。

CKD疾病腎間質纖維化涉及到多種信號通路的激活[10]，其中TGF-β1在腎間質纖維化中起到關鍵的作用[11]，TGF-β1借助Smads家族中的轉導分子轉移到核內發揮基因調控作用[12]。Smad3是一個受體激活型小分子蛋白，可以促進TGF-β1信號轉導[13-14]。本研究顯示，模型組TGF-β1和Smad3蛋白顯著高于假手術組，說明了腎間質纖維化TGF-β1/Smad3信號通路的激活，而依那普利組TGF-β1和Smad3蛋白低于模型組，說明依那普利可以抑制TGF-β1/Smad3信號通路。NF-κB是炎癥和纖維化調控的上游通路，可以調節TGF-β1表達，P65是NF-κB通路中的關鍵蛋白，P65入核增多說明NF-κB通路的激活。本研究顯示，模型組P65蛋白顯著高于假手術組，說明NF-κB通路的激活，而依那普利組P65蛋白低于模型組，說明依那普利可以抑制NF-κB通路信號通路，對TGF-β1/Smad3的抑制有可能是通過抑制NF-κB通路實現的，具體機制還有待進一步的實驗研究來闡明。