膽管癌中轉錄因子EB和自噬相關蛋白Beclin 1的表達及其與預后的關系

阮 萍，何婷婷，彭忠異，姚 平

膽管癌的手術治療切除率低，缺乏有效的輔助化療藥物，且術后復發率高[1]。尋找標志性致癌分子，深入探討膽管癌發生、發展的機制，是提高膽管癌治療效果和預后的關鍵所在。細胞自噬(autophagy)對于腫瘤來說是一柄雙刃劍[2]。轉錄因子EB(transcription factor EB, TFEB)可通過調節從自噬小體形成到降解的整個過程中各種相關基因的表達來調節自噬水平[3]。但關于TFEB在膽管癌中與自噬關系的研究尚未見報道。本實驗通過檢測TFEB和自噬相關蛋白Beclin 1在膽管癌中的表達，探討TFEB和Beclin 1作為膽管癌預后指標的可能性。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2011年1月～2017年12月廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院手術切除并確診的75例膽管癌手術標本(其中肝內膽管癌24例、肝外膽管癌51例)。同時收集所有病例完整的臨床資料與隨訪信息，患者術前均未行放、化療及生物治療。隨訪截至2018年1月。手術日期至復發日期或末次隨訪日期為無復發生存時間，手術日期至死亡日期或末次隨訪日期為總生存時間。肝內膽管癌隨機選取同期手術切除的20例肝細胞癌(無病毒性肝炎感染史、肝硬化病變及膽道結石病史)的癌旁正常膽管作對照分析，肝外膽管癌隨機選取同期手術切除的20例經病理學證實未發現腫瘤細胞浸潤的陰性切緣標本作為對照分析。本組所有組織標本的獲取均取得患者知情同意，簽訂由醫院倫理委員會批準的患者知情同意書。

1.2 主要試劑兔抗人TFEB和Beclin 1多克隆抗體為美國Novus公司產品、PV 9000兩步法免疫組化檢測試劑盒及濃縮型DAB染色試劑盒均為北京中杉金橋公司產品，其他常用試劑均為國產分析純試劑。

1.3 免疫組化標本均經10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋。切片經二甲苯脫蠟及梯度乙醇至水化；按抗體說明書進行檸檬酸鹽或EDTA高溫高壓修復；3%H2O2抑制內源性過氧化物酶；滴加適當濃度的一抗工作液，4 ℃冰箱孵育過夜；按試劑盒說明書EnVision兩步法滴加二抗；滴加DAB顯色。對照設計：每批染色分別用一抗說明書建議的組織切片作陽性對照；以非免疫正常兔血清代替一抗作為陰性對照；空白對照以PBS代替一抗。

1.4 結果判定Beclin 1以胞質呈棕黃色顆粒為陽性，TFEB以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性。隨機選取5個高倍視野(400×)，每個視野計數100個腫瘤細胞。按細胞染色強度計分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細胞所占百分比計分：無陽性細胞或陽性細胞數<5%為0分，陽性細胞數占5%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。將兩項得分結果相加作為最終結果：>4分為高表達，≤4分為低表達[4]。

1.5 統計學方法所有數據均采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計數資料的描述采用率或構成比。計數資料采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制無復發生存曲線及總生存曲線，Log-rank法對組間生存率進行比較。初步篩選無復發生存率和總體生存率的影響因素。將各臨床病理因素納入Cox比例風險模型進行多因素分析，確定預后影響因素。Beclin 1和TFEB的表達相關性采用Spearman等級相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膽管癌中TFEB及Beclin 1表達TFEB蛋白表達主要定位于膽管癌組織與癌旁正常膽管上皮細胞的胞核。在肝內膽管癌中TFEB蛋白高表達12例(50.00%)，癌旁正常膽管上皮高表達2例(10.00%)，兩組相比差異有統計學意義(χ2=8.046，P=0.005)。在肝外膽管癌中TFEB蛋白高表達24例(47.06%)，癌旁正常膽管上皮高表達1例(5.00%)，兩組相比差異有統計學意義(χ2=11.14，P=0.001，圖1A、B)。

Beclin 1蛋白主要定位于膽管癌組織與癌旁正常膽管上皮細胞的胞質。在肝內膽管癌中Beclin 1蛋白高表達10例(41.27%)，癌旁正常膽管上皮高表達4例(20.00%)，兩組相比差異無統計學意義(χ2=0.361，P=0.124)。在肝外膽管癌中Beclin 1蛋白高表達24例(47.06%)，癌旁正常膽管上皮高表達2例(10.00%)，兩組相比差異有統計學意義(χ2=13.824，P<0.001，圖1C、D)。

ABCD

在12例TFEB高表達肝內膽管癌中，Beclin 1高表達4例；12例TFEB低表達肝內膽管癌中，Beclin 1低表達6例。24例TFEB高表達肝外膽管癌中，Beclin 1高表達2例；27例TFEB低表達肝外膽管癌中，Beclin 1低表達5例。通過Spearman相關性分析表明，肝內及肝外膽管癌中TFEB及Beclin 1的表達呈負相關，其中肝外膽管癌中TFEB及Beclin 1的負相關差異有統計學意義(rs=-0.731，P<0.001)。

2.2 膽管癌中TFEB及Beclin 1表達與臨床病理特征的關系75例膽管癌中，TFEB表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、血管侵犯及AJCC分期呈正相關(P均<0.05)，與患者年齡、性別、解剖部位及分化程度無關(P均>0.05)；Beclin 1表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、血管侵犯及AJCC分期呈負相關(P均<0.05，表1)。

2.3 膽管癌中TFEB及Beclin 1表達與患者預后的關系75例膽管癌患者中位隨訪時間18.32個月，52例死亡，死亡原因均為腫瘤復發轉移、病情進展導致的多器官衰竭，無其他死亡原因。肝內膽管癌TFEB低表達組中位無復發生存期(6.53個月)及中位總生存期(21.80個月)均比高表達組長(3.40、6.17個月)，高、低表達組中位總生存期差異有統計學意義(χ2=4.937，P=0.026)。肝外膽管癌TFEB低表達組中位無復發生存期(23.10個月)及中位總生存期(36.77個月)均比高表達組長(6.33、11.70個月)，高、低表達組的中位無復發生存期及中位總生存期差異均有統計學意義(χ2=12.278，P<0.001；χ2=12.955，P<0.001)。

表1 膽管癌中TFEB及Beclin 1表達與臨床病理特征的相關性

肝內膽管癌中Beclin 1高表達組中位無復發生存期(41.37個月)及中位總生存期(43.47個月)均比低表達組長(4.33、6.10個月)，中位無復發生存期及中位總生存期差異均有統計學意義(χ2=10.816，P=0.001；χ2=17.072，P<0.001)。肝外膽管癌中Beclin 1高表達組中位無復發生存期(36.23個月)及中位總生存期(38.77個月)均比低表達組長(4.97、9.93個月)，中位無復發生存期及中位總生存期差異均有統計學意義(χ2=20.237，P<0.001；χ2=18.516，P<0.001，圖2)。

單因素分析顯示，膽管癌的無復發生存期及總生存期與患者年齡、解剖部位、腫瘤大小、血管侵犯、AJCC分期、TFEB及Beclin 1表達等因素有關(P均<0.05，表2)。將上述單因素分析差異具有顯著性的指標納入Cox比例風險模型，分別對無復發生存期和總生存期進行多因素分析，結果顯示，TFEB及Beclin 1表達均是影響肝內、肝外膽管癌患者術后總生存期及無復發生存期的顯著性因素，TFEB是不良預后因素，而Beclin 1是保護因素。淋巴結轉移是影響肝內膽管癌患者術后總生存期及無復發生存期的顯著性不良預后因素，血管侵犯是影響肝內膽管癌患者術后總生存期的顯著性不良預后因素(P=0.045)。AJCC分期是影響肝外膽管癌患者術后總生存期及無復發生存期的顯著性不良預后因素(P均<0.05，表3、4)。

3 討論

膽管癌是一種起源于膽管上皮的惡性腫瘤，發病率占胃腸道系統所有惡性腫瘤的3%[5]。我國膽管癌的發病率普遍高于世界平均水平，上海市膽道癌研究協作組1997～2001年進行的流行病學研究結果顯示，上海35～74歲市民膽管癌的發病率為0.58/10萬人，低于泰國的96.00/10萬人，高于澳大利亞的0.20/10萬人[6]。膽管癌發病隱匿，惡性程度高，晚期膽管癌的5年生存率為5%～15%[1]。手術治療是膽管癌的首選方案，但手術治療切除率較低，且膽管癌高度促結締組織增生的能力、多樣的腫瘤微環境及高度的異質性決定了其易對化療藥物產生耐藥性[1]，目前尚無針對膽管癌十分有效的靶向治療藥物，因此深入研究膽管癌的發病機制，從而更為有效地治療膽管癌，提高患者預后是目前研究的重中之重。

圖2 膽管癌中TFEB及Beclin 1與患者無復發生存期和總生存期的關系：A.TFEB表達與無復發生存期的關系；B.TFEB表達與總生存期的關系；C.Beclin 1表達與無復發生存期的關系；D.Beclin 1表達與總生存期的關系

表2 膽管癌患者術后無復發生存期及總生存期的單因素分析

自噬是細胞在各種代謝壓力下(如能量缺乏、饑餓等)的一種促使胞內代謝廢物降解的生物學行為，是真核細胞進行自我消化從而獲得存活機會的一種高度保守生物學過程。研究證實，自噬在膽管癌的發生、發展、血管生成、轉移、復發、耐藥等方面有著重要影響，在膽管癌發展的最初階段表現為自噬的抑制，而在腫瘤發展及侵襲的過程中自噬標記的蛋白表達增加[7]。在過去幾十年，自噬的研究主要集中在其起始階段，近年來的研究逐漸集中在溶酶體(lysosome)上。TFEB蛋白屬于基本螺旋環螺旋亮氨酸拉鏈(basic helix-loop-helix-leucine-zipper, bHLH-LZ)類轉錄因子中MiT家族成員，通過調控溶酶體途徑及細胞自噬在不少腫瘤的發生、發展過程中發揮了重要的作用[8]。TFEB入核后，主要通過兩種分子作用機制發揮自噬轉錄調控作用：(1)通過轉錄激活多種自噬相關分子的表達，使細胞自噬活性增強；(2)通過結合靶分子的E-box結合元件，轉錄激活溶酶體通路相關分子，尤其是溶酶體膜蛋白1(lysosomal-associated membrane protein 1, LAMP 1)的表達，促進溶酶體外排。這種機制能夠顯著增強溶酶體的合成與外排，被稱為協同溶酶體表達與調控網絡(coordinated lysosomal expression and regulation network, CLEAR network)[9]。許多研究提示，腫瘤發生過程中TFEB的表達和活性會發生改變，如腎細胞癌、胰腺導管細胞癌、惡性膠質瘤、黑色素瘤、肺小細胞癌及乳腺癌等[10-11]。那么TFEB在膽管癌發病過程中扮演著何種角色？是否參與了膽管癌細胞自噬的調節，與膽管癌的病程發展及侵襲性、復發等生物學行為關系如何？至今國內外尚未見相關研究報道。本實驗結果表明，與癌旁正常組織相比，肝內、外膽管癌的TFEB均出現過表達。且膽管癌中TFEB高表達與腫瘤的惡性進展和患者的預后不良有關。TFEB高表達組患者的無復發生存期及中位總生存期低于低表達組，且在TFEB高表達組中，淋巴結轉移及血管侵犯更多見。這與Liang等[12]在結腸癌的發現一致，敲除結直腸癌細胞的TFEB基因能阻止腫瘤細胞的增殖和擴散。這可能與沉默TFEB后，腫瘤細胞相互間黏附能力增強，而侵襲力降低有關[13]。

表3 肝內膽管癌患者術后無復發生存期及總生存期的多因素分析

表4 肝外膽管癌患者術后無復發生存期及總生存期的多因素分析

在已發現的自噬相關蛋白中，Beclin 1是目前發現的哺乳動物中參與自噬的特異性基因，其在自噬泡形成過程中起重要作用。Sasaki等[14]研究發現，與非腫瘤性大膽管上皮細胞相比，膽管上皮內瘤變、膽管內乳頭狀瘤等系列癌前病變及膽管浸潤性癌細胞中的LC3、Beclin 1及p62表達均有顯著增高，提示自噬參與膽管癌的發生、發展進程。本實驗在探討膽管癌中Beclin 1與臨床病理特征及預后的關系時，卻呈現與前述研究相反的結果。Beclin 1高表達組的患者往往呈現小體積腫瘤、無淋巴結轉移及血管侵犯、低級別的AJCC分期等，提示Beclin 1高表達組患者有更長的生存期及無復發生存期，這與Dong等[15-16]的研究結果相一致。提示Beclin 1不僅可能成為膽管癌預后良好的預示指標，可能為膽管癌治療方案的確定提供潛在的臨床應用。另一方面，Zhang等[17]研究證實，Beclin 1過表達不僅可通過誘導結腸癌HCT-15和HCT-116細胞增殖下降、細胞周期紊亂、吞噬增加和凋亡來抑制結腸癌細胞的生長，而且還可減少結腸癌細胞的遷移、侵襲和片狀脂膜的形成從而抑制結腸癌的侵襲和轉移。本實驗中Beclin 1低表達與淋巴結轉移及血管侵犯具有相關性，同樣提示Beclin 1表達缺失可能是腫瘤侵襲性生長及轉移的危險因素。有趣的是，在Beclin 1低表達患者的分層生存分析中，肝內膽管癌患者的總體生存期和無復發生存期均少于肝外膽管癌，這可能提示自噬對肝內膽管癌這一亞群的影響更大，該亞群自噬水平的下調與較差預后相關。

本實驗同時也揭示，肝內、外膽管癌中TFEB及Beclin 1的表達呈負相關，其中樣本例數較多的肝外膽管癌中兩者表達呈顯著負相關。這提示Beclin 1低表達可能與TFEB高表達相關，TFEB通過抑制Beclin 1表達，從而調節自噬，促進腫瘤生長和轉移。這兩個指標相結合，可作為膽管癌的預后因素和潛在的治療靶點。

綜上所述，TFEB可能通過下調Beclin 1表達從而調控、抑制膽管癌的自噬，從而導致了膽管癌的發生、發展及不良預后。在未來的研究中，本課題組將深入探討自噬影響膽管癌發生、發展以及膽管癌中自噬調控的具體機制，以期為膽管癌的臨床治療領域提供新的基因靶點。