實驗小鼠脂肪組織石蠟切片制作方法的改進

菅曉婷，付 超，岳 丹，杜圣家，郭林芝

脂肪組織是機體重要的能量倉庫，廣泛分布于全身的皮下及內臟各處[1]，薄層疏松的結締組織將其分割成許多小葉結構[2]，小葉內有大量的脂肪細胞。近年來，人們越來越重視對脂肪組織的研究[3-5]，而這些研究都離不開形態學方面(如HE、免疫組化染色)的觀察。因此，制作優質的脂肪組織切片標本至關重要。由于脂肪組織結構特殊，含有大量的油脂成分，如果組織固定、脫水脫脂不完全，切片時往往出現組織碎渣，有空洞、觸摸較軟、放置后蠟塊表面有凹陷、不易保存等各種問題影響后續的觀察及研究[6-8]。本實驗室參照董學易等[9]的方法制作脂肪組織石蠟切片，雖基本滿足形態學研究，但整個流程所用時間較長，效率較低，減慢了科研進程。為制作更好的脂肪組織石蠟切片，同時縮短制作時間，本科室在此基礎上進行改進，并應用于免疫組化和免疫熒光染色，獲得了較為滿意的結果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 清潔級BALB/c雄性小鼠6只，8周齡，體重22～25 g，均購自山西醫科大學實驗動物中心。

1.1.2實驗試劑及儀器 Leica RM2245型半自動旋轉式切片機；10%中性福爾馬林、95%乙醇、二甲苯購自天津市大茂化學試劑廠；切片石蠟(熔點60～62 ℃)購自北京北化康泰臨床試劑公司；蘇木精、伊紅染液購自珠海貝索公司；Rabbit Anti-GLP-1R antibody(貨號bs-1559R)購自北京博奧森生物公司；山羊抗兔IgG/HRP聚合物(貨號PV-6001)和山羊抗兔IgG/TRITC(貨號ZF-0316)均購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1取材及組織處理 頸椎脫臼法處死實驗小鼠，每只鼠分別取雙側睪丸脂肪墊，雙側腎周脂肪組織及2塊大小均等的腸系膜脂肪組織，標本共36塊，大小為(0.5～1.5)cm×(0.5～1.5)cm×(0.2～0.3)cm，三個部位的脂肪組織均等分為實驗組和對照組，每組各18塊。所有標本均經10%中性福爾馬林浸泡固定。其中，對照組標本采用董學易等[9]所述程序進行，實驗組標本采用改進程序進行(表1)。處理好的脂肪組織標本用Leica石蠟包埋機進行包埋。

表1 兩組脂肪組織處理流程表

1.2.2切片、展片及烤片 用Leica RM2245型半自動旋轉式切片機進行切片，切片厚4 μm。在水溫42 ℃進行展片，60 ℃烤片30 min～1 h。

1.2.3HE、免疫組化及免疫熒光染色 HE、免疫組化及免疫熒光染色按常規流程進行，抗體為Rabbit Anti-GLP-1R antibody，陽性表達定位于細胞膜，免疫組化采用DAB顯色，免疫熒光采用TRITC顯色。

2 結果

2.1 兩組脂肪組織切片、展片及HE染色比較實驗組脂肪組織蠟塊質地均勻，組織完整，呈淡黃色半透明狀，可進行連續切片，且切片完整無空洞，無碎渣，展片完全，無褶皺，組織未散。經HE染色，鏡下可見脂肪組織無裂縫，細胞排列緊密，形態飽滿，呈多邊形空泡狀，胞核呈扁圓形，清晰可見，胞膜無明顯斷裂、松散(圖1A)。

對照組脂肪組織石蠟塊與實驗組石蠟塊相比無明顯區別，可連續切片，但組織中央可見細小裂縫，展片后明顯。經HE染色，鏡下可見脂肪組織形態基本完整，局部可見裂縫，細胞排列緊密，但形態欠飽滿，胞核扁平，清晰可見，部分細胞膜有斷裂，松散(圖1B)。

2.2 實驗組脂肪組織石蠟切片在免疫組化和免疫熒光中的應用實驗組切片在進行免疫組化和免疫熒光染色過程中未見明顯脫片，鏡下可見脂肪組織完整，細胞形態飽滿，胞膜完整，免疫組化標記GLP-1R呈棕黃色，免疫熒光可見較強的紅色信號，陽性表達明顯，背景清晰(圖2)。

①A①B②A②B

3 討論

脂肪組織主要由脂肪細胞構成，脂肪細胞內含有大量脂滴，而脂滴的主要成分是三酰甘油脂。由于其成分的特殊性，不能按照普通組織的脫水流程進行處理，若脫水、脫脂不完全，石蠟便難以進入組織從而起不到支撐作用，蠟塊中的組織會塌陷、皺縮，切片時會出現空洞，碎渣等情況。實驗室常用的脫水、脫脂試劑為乙醇，乙醇分子中含有極性基團羥基(-OH)，與組織中的水形成氫鍵將水置換出來起到脫水作用。通過本實驗，作者認為對于含水少的脂肪組織，乙醇除了有脫水作用，還可以與三酰甘油脂發生醇解反應，生成水溶性的甘油和乙酯，將脂肪細胞中的脂滴溶解，從而使浸蠟更為徹底。也有文獻記載乙醇脫脂是利用乳化作用[10]。但是，不論乙醇是應用何種原理脫脂，都會消耗大量乙醇，所以我們需要延長乙醇處理組織的時間。雖然有研究表明溫度一定的條件下，乙醇濃度越高，脫脂率會越高[11]，但高濃度的乙醇迅速脫水，會使組織收縮，表面變硬，進而影響乙醇繼續進入細胞內脫水脫脂，所以應當從低濃度乙醇開始逐漸向高濃度乙醇梯度過渡，并且延長中低濃度乙醇脫水時間。本文實驗組與對照組相比，增加了70%乙醇和90%乙醇，并延長了在低濃度乙醇中的時間，縮短了在高濃度乙醇中的時間，組織充分脫水脫脂，取得了較為滿意的制片效果。而對照組程序乙醇梯度設置少，且脫水、脫脂時間延長主要在95%乙醇，以至組織迅速收縮，乙醇很難進入細胞溶解置換脂質并進行脫水，最后制作的石蠟塊在切片時有裂縫，使形態學觀察及后續研究受到一定影響。

此外，二甲苯不僅有透明作用，也有良好的脫脂效果，二甲苯可以兼顧乙醇脫脂不徹底的情況[12]，但是組織浸泡二甲苯時間過長會硬化變脆。制作一張優質的脂肪切片，固定也尤為重要，固定液體積要為標本體積的10～20倍[13]，并且蓋上紗布以防脂肪組織漂浮固定不充分，但固定時間越長，抗原被封閉和破壞越多，影響免疫組化及分子生物學檢測的陽性率。與對照組相比，實驗組縮短了固定時間，不僅制出優質切片，而且免疫組化及免疫熒光染色檢測陽性率高，效果良好。

綜上，本實驗室改進了實驗小鼠脂肪組織石蠟切片的制作流程，使用改良流程制作的切片組織形態完整，無裂縫，無褶皺，經染色可見胞膜完整，胞核清晰，抗原保存好，極大地提高了科研的進度，為后續科研的進行提供了優質的切片基礎。