Rhodosporidiobolus odoratus菌株GZ2017中真菌病毒的分離和鑒定

張婷婷，蔡小姚，滕 麗，3，劉紅美，尚小麗*

(1.貴州醫科大學 生物與醫學工程重點實驗室，貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫科大學 環境污染與疾病監控省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫科大學 基礎醫學院，貴州 貴陽 550025)

真菌病毒是指可以侵染絲狀真菌、酵母和卵菌，并能在其中復制的病毒。在植物病原真菌中存在著大量的真菌病毒[1-3]。大多數情況下，真菌病毒感染寄主表現為無癥狀，通常稱為潛伏或隱性感染。此外，研究表明，大多數真菌病毒是雙鏈RNA(dsRNA)病毒。目前，具有dsRNA基因組的真菌病毒主要由6個科[呼腸孤病毒科(Reoviridae)、全病毒科(Totiviridae)、雙分病毒科(Paritiviridae)、產黃青霉病毒科(Chrysoviridae)、四分體病毒科(Quadriviridae)、巨型雙節段病毒科(Megabirnaviridae)]和最近提出的Botybirnaviridae家族組成。現已將全病毒科家族中的病毒分為5個屬：全病毒屬(Totivirus)、維多利亞屬(Victorivirus)、梨形鞭毛蟲病毒屬(Giardiavirus)、滴蟲病毒屬(Trichomonasvirus)和利什曼原蟲病毒屬(Leishmaniavirus)[4]。其中，全病毒屬和維多利亞屬的病毒主要感染真菌，而滴蟲病毒屬、梨形鞭毛蟲病毒屬和利什曼原蟲病毒屬則常存在于原生動物中[5]。最近又提出了另外兩個屬，分別為感染魚類和節肢動物的Artivirus屬[6]和感染昆蟲的Insevirus屬[7]。Rhodosporidiobolusodoratus是Rhodosporidiobolus屬的一個新種，首次從不同樹種(楓木、檸檬、平面和玉米)的葉狀平面中分離到(以前稱為Sporobolomycesodoratus)[8]。近年，從葡萄、葡萄汁或葡萄酒中也分離出擬酵母形態的Rhodosporidiobolusodoratus[9]。

油茶是一種起源于中國的獨特油種，具有重要的經濟價值，其衍生物廣泛用于化學工業、食品、飼料等工業[10]。但是，隨著自然生態環境的變化，油茶的病害明顯，嚴重影響其利用價值。油茶具有多種病害，其中油茶葉腫病又名茶餅病、葉枯病，主要危害油茶花芽和葉芽，該病害在我國絕大多數油茶基地普遍發生。葉腫病通常以油茶幼葉的部分或完整葉片腫大成變態葉為基本特征，俗稱茶耳、茶片和木子耳；或使頂芽腫大變形為空心泡狀的變態芽，俗稱茶泡或茶苞[11-12]。油茶葉腫病是由細麗外擔菌[Exobasidiumgracile(Shirai)Syd]侵染油茶幼芽和幼葉引起的真菌性病害，病原菌感染油茶幼嫩的花芽和葉芽后，促進油茶的組織增生、細胞膨大而成為變態芽和變態葉，導致葉片干枯脫落，已經嚴重影響到油茶的種植和生產[13-14]。因此，筆者首次從油茶的茶耳表面分離出了Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017，而且檢測出其攜帶真菌病毒。在此基礎上，側重于獲取Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017中攜帶的真菌病毒的全基因組序列，并且對其進行基因組解析，從而明確病毒的分類學地位。并將此病毒命名為RhodosporidiobolusodoratusTotivirus1 (RoTV1)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017從油茶茶耳表面上分離得到，長期保存于-80℃。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNase I酶、S1 Nuclease酶、M-MLV反轉錄酶、Klenow酶、pMD18-T載體、T4RNA連接酶均購自寶生物工程(大連)有限公司；氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DNA膠回收試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；2×PCR mix購自北京康潤誠業生物科技有限公司；DH5α感受態細胞購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司；恒溫培養箱，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；電泳儀，北京六一公司；凝膠成像儀，北京君意東方電泳設備有限公司；恒溫振蕩器，太倉市實驗設備廠；PCR儀，美國ABI公司。

1.1.3 培養基 PDA培養基：土豆200 g，切片，用去離子水1.4 L煮沸，過濾，量取1 L浸出液，加入葡萄糖20 g，瓊脂15 g，121℃恒溫高壓濕氣滅菌20 min。LB培養基：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，瓊脂15 g，加蒸餾水定容至1 L，121℃恒溫高壓濕氣滅菌20 min。

1.1.4 引物設計 試驗引物由武漢天一輝遠公司合成，引物及序列詳見表1。

1.2 dsRNA的獲取

將目的菌株接種至加有玻璃紙的PDA平板上，恒溫培養箱中28℃擴大培養，待菌株完全生長后撕下玻璃紙放入研缽中，用液氮將其研磨成粉末狀，取約0.5 g裝入2.0 mL 離心管中。將0.6 mL 2×GPS、0.6 mL苯酚、0.6 mL氯仿∶異戊醇(24∶1)和138 μL 10% SDS依次加入樣品中，室溫下充分震蕩，12 000 r/min離心10 min。將0.04 g無離子纖維素粉末(CF-11)放入無菌2.0 mL 離心管中，取0.6 mL上清液緩慢移入管中，并且每0.6 mL上清液加114 μL無水乙醇，混勻后4℃冰浴過夜。然后離心機12 000 r/min離心5 min后棄上清，倒扣濾紙上吸干殘液，移液器加入0.6 mL清洗

表1 試驗引物設計

緩沖液，混勻后靜置1 min；重復洗脫3次，加入640 μL 1× STE，混合搖勻，12 000 r/min離心8 min后吸取0.6 mL上清至1.5 mL的離心管，加入60 μL的3 mol/L 醋酸鈉(pH 5.2)，0.6 mL的異丙醇(或1.2 mL無水乙醇)，混勻，-20℃下預沉淀2 h，4℃離心機12 000 r/min離心30 min，去除上清液，沉淀用500 μL 75%酒精進行洗脫，12 000 r/min，4℃，離心5 min，瀝干上清液，并在37℃恒溫箱中干燥待其酒精揮發干凈，用20 μL DEPC-H2O溶解沉淀，即為粗提的RNA樣品，保存于-80℃備用。

1.3 dsRNA純化及鑒定

DNaseI酶用于鑒定提取的核酸條帶是否為DNA，S1 Nuclease酶用于鑒定提取的核酸條帶是否為ssRNA，RNase A用于鑒定所提取的樣品是否為RNA。利用DNase I酶處理樣品的PCR體系為1 μL DNase I酶、89 μL樣品、10 μL DNase I Buffer；反應程序37℃、30 min，65℃、5 min，反應結束后取5 μL備用；利用DNase I酶處理過的樣品再用S1 Nuclease酶處理，PCR體系為0.1 μL S1 Nuclease酶、44.9 μL DNase I酶處理的樣品、5 μL S1 Nuclease酶buffer；反應程序37℃、30 min，65℃、5 min，反應結束后取5 μL備用。另取新的樣品用RNase A處理，PCR體系為0.2 μL RNase A、4 μL樣品、1 μL RNase A Buffer、4.8 μL ddH2O；反應37℃、30 min。反應結束后取5 μL備用。然后將DNase I酶、S1 Nuclease酶、RNase A處理的備用的5 μL樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.4 dsRNA中間序列的獲取

將經過DNase I酶和S1 Nuclease酶處理的樣品用清潔回收試劑盒回收，所得的樣品通過反轉錄酶反轉后所得的cDNA樣品用Klenow Fragment酶進行補平，補平條件為37℃、2 h，65℃、5 min，隨后將補平的樣品進行PCR隨機擴增，擴增條件為94℃預變性4 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個循環；72℃保持5 min。所得樣品通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離不同大小的隨機片段，將凝膠中750～1 000 bp的隨機片段切下，裝入離心管中，利用DNA膠回收試劑盒進行回收，回收的樣品過夜連接pMD18-T載體，然后從-80℃超低溫冰箱中取出DH5α感受態細胞放在冰上融化；取10 μL連接產物放入裝有25 μL感受態細胞的離心管中，冰浴30 min；42℃熱激70 s，立即放置冰上冰浴5 min；每管體系加入500 μL 37℃預熱的未加Amp抗生素的LB液體培養基，放在37℃環境中200 r/min搖床中培養1 h；取部分菌液涂在加有Amp的LB培養皿上；作好標記后放置在37℃培養箱中培養12～15 h。次日從培養皿中挑取20～30個陽性轉化子分別加到有Amp的0.6 mL LB液體培養基中擴大培養5 h，同時對這20～30個陽性轉化子用通用引物M13-47和M13-48進行PCR鑒定，PCR條件反應程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，30 個循環；72℃保持5 min，根據凝膠電泳檢測結果，將陽性轉化子菌液進行測序，測序結果進行序列分析及拼接，獲取dsRNA中間片段。

1.5 dsRNA末端序列的獲取

RoTV1兩末端非編碼區結構復雜，不能通過隨機片段擴增得到，需在獲得RoTV1中間序列的基礎上在2個末端加上1個接頭引物后反轉錄成cDNA，另一端再用基于已獲取的RoTV1片段，設計特異引物進行PCR擴增才能得到末端序列。即將dsRNA樣品加接頭連接，反應體系為dsRNA14 μL，REV-anchor 2 μL，DMSO 2 μL，充分混勻94℃保持2 min后取出立刻放置冰上冰浴1 min，然后立即加入PEG4000 17 μL，10× T4RNA buffer 5 μL，RRI 2 μL，BSA 5 μL，T4RNA連接酶4 μL，混勻，16℃連接過夜。將加接頭的50 μL體系加入DEPC水補足600 μL，加入600 μL氯仿混勻，4℃離心機12 000 r/min離心10 min；取570 μL的上清液，加入0.1倍體積的3 mol/L 醋酸鈉以及等體積的異丙醇，-20℃下沉淀2 h；4℃離心機12 000 r/min高速離心30 min，緩慢倒掉上清，室溫晾干，加入20 μL的DEPC-H2O。取14 μL樣品用反轉錄酶進行反轉，所得樣品通過設計的末端特異引物進行PCR，PCR樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，將目的片段切膠回收，連接pMD18-T載體，進行轉化，將陽性轉化子菌液送公司測序，然后分析測序結果獲取末端序列。

1.6 序列拼接及系統進化分析

序列拼接和開放閱讀框(ORF)的預測使用DNAMAN5.0軟件；序列同源性搜索使用NCBI網站的在線BLAST程(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；系統進化樹的構建使用最大似然法(ML)。ML樹的計算使用MEGA7.0軟件，采用默認參數設置，并以自展法(bootstraP)對ML樹進行評估，重復抽樣次數為1 000，系統進化樹分析中所用的病毒如下(表2)。

表2 系統進化樹分析所用的病毒

2 結果與分析

2.1 分離菌株GZ2017中的真菌病毒

如圖1所示，菌株GZ2017攜帶3條清晰的病毒條帶，在4～5 kb有1條病毒條帶為dsRNA1；在1 kb左右有2條病毒條帶，分別為dsRNA2、dsRNA3。該病毒命名為Rhodosporidiobolus odoratus Totivirus 1(RoTV1)。

2.2 dsRNA真菌病毒鑒定

如圖2所示，經DNase I酶、S1 Nuclease酶、RNase A處理粗提的樣品，DNase I酶處理后去掉了DNA條帶，RNA條帶無變化；S1 Nuclease酶處理后DNA條帶與RNA條帶無變化；RNase A處理后RNA條帶消失。表明，菌株GZ2017攜帶的真菌病毒為dsRNA真菌病毒。

2.3 RoTV1中間序列的獲取

如圖3A所示，Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017攜帶的dsRNA經反轉錄后用隨機引物RACE-3擴增得到大量隨機片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈彌散條帶。切下750～1 000 bp的隨機片段進行膠回收、連接、篩選得到陽性克隆，在1%瓊脂糖凝膠上呈大小不一的單一片段(圖3B)。挑取較大的隨機片段進行測序，測序結果分析后用DNAMAN軟件進行序列拼接。

2.4 RoTV1末端序列的獲取

如圖4所示，擴增得到的末端序列通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(部分結果)條帶清晰。可用于下一步的回收、連接、轉化、測序試驗。

2.5 RoTV1 dsRNA1基因組序列

從Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017中提取的RhodosporidiobolusodoratusTotivirus 1(RoTV1)病毒，經過測序得出其基因組由3個片段(dsRNA 1-3)組成，長度分別為4 675 bp、1 183 bp和1 112 bp，已獲取GenBank數據庫登錄號，分別為MN937194、MN937195和MN937196。dsRNA1的序列全長為4 675 bp，G+C含量為53.3%。使用通用的遺傳密碼翻譯，dsRNA1基因組包含2個不連續的大的開放閱讀框(ORF)，位于基因組正鏈

的不同框架中。dsRNA1的5′和3′非翻譯區(UTR)分別長63 bp和335 bp。5′-ORF(ORF1)位于63～2 112 bp，編碼的蛋白有682個氨基酸，分子量大小是75.6 kDa。3′-ORF(ORF2)不與ORF1重疊，位于2 120～4 340 bp，編碼的蛋白有711個氨基酸，分子量大小是79.2 kDa。RoTV1的2個ORF(ORF1和ORF2)相隔92 bp。在ORF1的終止密碼子TAG(2 110 bp到2 112 bp)之間發現了1個潛在的移碼序列七聚體(GGATTTT，1 993～2 000 bp)(圖5)。在XdV-L1A和XdV-L1B中也發現了相同的移碼七聚體[15]。在這種情況下，ORF2與ORF1可能通過-1核糖體移碼機制，從63～4 341 bp處，融合成為1個大的融合蛋白(Gag-Pol蛋白)。

2.6 RoTV1 dsRNA2、dsRNA 3基因組序列

dsRNA2和dsRNA3的全長分別是1 183 bp和1 112 bp。經DNAMAN分析，在dsRNA2和dsRNA3中未發現編碼有意義的大ORF，只發現dsRNA2和dsRNA3編碼的小ORF。對dsRNA2和dsRNA3編碼的小ORF進行BLASTp分析顯示，無任何已知的蛋白質與dsRNA2和dsRNA3的小ORF編碼的蛋白質有相似性。此外，使用不同濃度的環己酰亞胺處理Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017時發現，dsRNA2和dsRNA3不會丟失，也不能跟dsRNA1分開(圖6)。因此，可以看出dsRNA1，dsRNA2，dsRNA3在菌株GZ2017中非常穩定和相互依賴，推測dsRNA2和dsRNA3可能是dsRNA1的衛星RNA(SatRNA)。

2.7 基于RoTV1的RdRp區域構建系統進化樹

由圖7可見，根據RoTV1和選擇20種病毒RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)構建RoTV1的系統進化樹顯示，RoTV1與Totiviridae科Totivirus屬的XdV-L1B、XdV-L1A、RPaTV3、BrV-F、ScV-L-A、TaV1聚成一簇，與其他病毒相距較遠。因此，從RoTV1的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)系統進化的角度證實了RoTV1是Totiviridae科Totivirus屬的新成員。

2.8 基于RoTV1的CP區域構建系統進化樹

由圖8可見，根據RoTV1和選擇20種RNA病毒的外殼蛋白(CP)構建RoTV1的系統進化樹顯示，RoTV1與Totiviridae科Totivirus屬的XdV-L1B，XdV-L1A，RPaTV3聚成一簇，與其他病毒相距較遠。因此，從RoTV1的外殼蛋白(CP)系統進化的角度再次證實了RoTV1是Totiviridae科Totivirus屬的新成員。

3 結論與討論

通過對Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017攜帶的真菌病毒RoTV1的研究得知，真菌病毒RoTV1含有3條病毒條帶，分別為dsRNA1、dsRNA2和dsRNA3。在獲取RoTV1的dsRNA1、dsRNA2和dsRNA3全基因組序列后，對dsRNA1進行序列分析得知，含2個閱讀框分別為ORF1和ORF2，對ORF1和ORF2進行BLASTp比對顯示，分別與Totiviridae科Totivirus屬病毒的外殼蛋白(CP)和RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)具有相似性。

對RoTV1的dsRNA2和dsRNA3進行序列分析時發現無編碼大的閱讀框，對其編碼的小閱讀框進行BLASTp比對也未發現任何同源蛋白。另外，使用不同濃度的環己酰亞胺(Cycloheximide)處理Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017時發現，即不能丟失dsRNA1、dsRNA2和dsRNA3，也不能將dsRNA1與dsRNA2和dsRNA3分開。因此，可以看出dsRNA1、dsRNA2、dsRNA3在菌株GZ2017中非常穩定和相互依賴，推測dsRNA2和dsRNA3可能是dsRNA1的衛星RNA(SatRNA)。

本研究首次從油茶茶耳表面分離出Rhodosporidiobolusodoratus菌株，而且發現其攜帶真菌病毒RoTV1。在成功獲得RoTV1的全基因組序列后，并對其基因組結構進行了解析，明確了真菌病毒RoTV1的分類學地位，在后續的研究中計劃獲取Rhodosporidiobolusodoratus菌株GZ2017的脫毒菌株(RoTV1-)，將RoTV1-與未脫毒菌株(RoTV1+)同時培養，檢測兩者在生長速度、表型，次級代謝產物的異同，從而初步了解RoTV1的存在是否對其寄主有影響。