腹部推拿對便秘型腸易激綜合征家兔ENS-ICC-SMC結(jié)構(gòu)的影響?

駱雄飛，趙 娜，劉斯文，李華南，張 瑋，王強松，王金貴△

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193； 2. 國家中醫(yī)藥管理局推拿手法生物效應(yīng)三級實驗室，天津 300193； 3. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是常見的消化系統(tǒng)疾病，屬于功能性胃腸病范疇，以持續(xù)或間歇發(fā)作的腹痛、腹脹、排便習(xí)慣和大便形狀異常為臨床表現(xiàn)。IBS影響全球5%～20%人的生活[1]，降低患者的生活質(zhì)量[2]，其程度不亞于糖尿病、肝硬化、腎功能不全，故而日益受到關(guān)注。由于IBS發(fā)病機理的復(fù)雜和多元性，目前尚無特異性治療方法。而傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的推拿療法在治療IBS方面積累了豐富的經(jīng)驗，對于各亞型IBS具有獨特療效。

腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system,ENS)-Cajal間質(zhì)細胞(interstitial cell of Cajal, ICC)-胃腸平滑肌細胞(smooth muscle cell,SMC)網(wǎng)絡(luò)是目前腸動力研究的熱點，ICC與腸神經(jīng)及臨近肌細胞間通過特殊的縫隙連接，形成ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)。ENS擔(dān)負著胃腸道的神經(jīng)反射和控制活動，調(diào)節(jié)腸道動力；ICC在神經(jīng)肌肉信號傳遞中起調(diào)節(jié)作用，與胃腸道蠕動功能密切相關(guān)；SMC是調(diào)控腸動力的關(guān)鍵性因素之一。腸動力的完成離不開ENS、ICC和SMC三者的共同協(xié)作，其中任一部分發(fā)生病變必將導(dǎo)致腸動力功能紊亂。本課題組以便秘型IBS家兔為研究對象，以ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)為切入點，探討腹部推拿調(diào)節(jié)便秘型IBS腸動力的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選用2月齡家兔50只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄不限，由天津裕達實驗動物養(yǎng)殖有限公司提供(合格證號SCXK津2016-0001)。

1.1.2 主要試劑 Anti-C-kit antibody(Abcam,英國，批號ab5506)；Anti-nNOS antibody(Abcam,批號ab2801，英國)；Fura-2/AM(sigma美國)；Pluronic-F127(sigma美國)；溴化乙錠(Ethidium Bromide,北京鼎國)；正常熔點的瓊脂糖凝膠(GIBCO,美國)；低熔點的瓊脂糖凝膠(GIBCO,美國)；無水乙醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；二甲苯(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋)；蘇木素染液(上海碧云天)。

1.1.3 主要儀器 EGEG-8D型八導(dǎo)智能胃腸電圖儀(合肥凱利光電科技有限公司)；5415D型離心機(Eppendorf,德國)；PTC-200型熱循環(huán)儀(Bio-Rad,美國)；倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS,日本)；TS-1型脫色搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；干燥消毒烤箱(DHG-9246A,上海精宏試驗設(shè)備有限公司)；水浴恒溫箱(DK-8,上海精宏試驗設(shè)備有限公司)；組織切片機(ST-10,北京世聯(lián)博研科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模方法 采用隨機、對照研究方法，按照計算機隨機數(shù)字表法將家兔分為空白對照組10只，模型對照組20只，腹部推拿組20只，采取冰水灌胃應(yīng)激法造模[3]。模型對照組、腹部推拿組家兔分籠獨立飼養(yǎng)，消除生物節(jié)律影響，每日晨8時冰水灌胃(0～4 ℃生理鹽水，20 ml/只/d，14 d)，普通飼料喂養(yǎng)，自由進水。

1.2.2 干預(yù)方法 腹部推拿組：研究者掌指關(guān)節(jié)自然伸直，四指并攏，以食指中指羅紋面接觸實驗家兔腹部關(guān)元和氣海穴。以肘關(guān)節(jié)帶動前臂做環(huán)形運動，以研究者食指中指面著力于實驗家兔腹部做順時針揉動，頻率30圈/min，操作5 min。造模結(jié)束后開始，每日治療1次，連續(xù)治療14 d。模型對照組：每日仰臥捆綁實驗家兔1次10 min，不給予腹部推拿，連續(xù)14 d；空白對照組：不給予任何干預(yù)。

1.2.3 觀察指標及檢測方法 排便情況：自造模開始，每日收集空白對照組、模型對照組、腹部推拿組家兔糞便，固定托盤收集后150 ℃烘干1.5 h，電子秤稱重烘干前后質(zhì)量，根據(jù)公式(烘干前-烘干后)/烘干前=含水率%，計算出每只家兔糞便含水率。驗證造模成功及干預(yù)效應(yīng)的標準為糞便含水率呈趨勢變化。胃及結(jié)腸肌電檢測：在實驗兔的胃與結(jié)腸體表投影處及左前肢腕關(guān)節(jié)上0.5 cm(放置參考電極)剪毛，用950 ml/L乙醇脫脂，將8個直徑0.7 cm的Ag2agcl圓盤電極用9.0 g/L氯化鈉注射液棉球覆蓋，電極放置順序。胃電：胃底-胃小彎-胃大彎-幽門；腸電：升結(jié)腸-橫結(jié)腸-降結(jié)腸-直腸，膠布固定，用胃腸電圖儀記錄10 min腸電圖，以1 min為一個時間段，分別計算每個時間的頻率(單位：Hz)和振幅(單位：mv)，記錄觀察結(jié)腸電信號變化；結(jié)腸傳輸功能檢測：制備殼聚糖/海藻酸鈣控釋微球[4]，制備異硫氰酸熒光素(FITC)標記殼聚糖。實驗前禁食24 h，自由飲水；FITC標記微球用蒸餾水分散均勻，各實驗組按照50 mg/kg體質(zhì)量給家兔灌胃，灌胃后分別在不同時間點(16、24 h)取胃、小腸、結(jié)腸三部分，使用小動物成像儀觀察FITC標記交聯(lián)微球在家兔胃腸道的分布情況；ENS-ICC結(jié)構(gòu)觀察：迅速取出結(jié)腸組織，將組織剖開去除內(nèi)容物，在解剖顯微鏡下用顯微解剖鑷將黏膜層和黏膜下層作為一層剝除，保留完整肌層制備石蠟切片。脫蠟后做C-Kit/nNOS免疫熒光雙重標記，封片劑封片后熒光顯微鏡下觀察圖像；電鏡觀察ENS-ICC-SMC超微結(jié)構(gòu)，迅速用冷刀片取結(jié)腸組織，長度為1 cm。沿系膜緣剖開，用冰鹽水漂洗去除內(nèi)容物，立即放入2.5%冷戊二醛溶液，放入4 ℃冰箱固定24 h。用0.2MPBS漂洗4次，每次15 min，再用l%0s04固定1.5 h，用0.2MPBS漂洗15 min。梯度丙酮50%、70%、90%、100%中脫水各4次，每次15 min；100%丙酮：環(huán)氧樹脂(1∶1)1 h，然后100%丙酮：環(huán)氧樹脂(1∶2)2 h，再純樹脂3 h以上。先滴1滴環(huán)氧樹脂至塑料膠囊，再將樣品挑入囊底插入標簽，灌滿環(huán)氧樹脂，用針尖調(diào)整樣品至合適位置，放入恒溫箱(60 ℃)聚合12 h。半薄切片(厚1.0～2.0 μm)，2%甲苯胺藍染色，在光鏡下觀察、確定黏膜層、環(huán)形肌層、縱行肌層。選定區(qū)域修塊進行超薄切片，超薄切片厚50～70 nm，400目銅柵網(wǎng)撈片。2%醋酸鈾染色15 min，檸檬酸鉛染色5 min，晾干。透射電鏡觀測比較各組ENS-ICC-SMC超微結(jié)構(gòu)變化并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腹部推拿對便秘型IBS模型家兔糞便含水率影響

圖1示，模型對照組家兔糞便含水率呈逐漸降低趨勢并低于空白對照組，腹部推拿干預(yù)后，糞便含水率有恢復(fù)趨勢。

圖1 各組家兔糞便含水率變化比較

2.2 腹部推拿對便秘型IBS模型家兔胃腸電活動的影響

表1示，相對于模型對照組，腹部推拿組胃電活動平均幅值有升高趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；相對于模型對照組，腹部推拿組腸電活動平均幅值與平均頻率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。表明腹部推拿可以有效刺激腸蠕動，增強腸電活動幅值和頻率，改善腸動力障礙兔的腸電活動損傷。另外，腹部推拿組腸電幅值和頻率高于空白對照組，可能與腹部推拿的即時效應(yīng)有關(guān)。

表1 各組家兔胃腸電活動變化比較

注：a.空白對照組；b.模型對照組；c.腹部推拿組圖2 小動物成像系統(tǒng)觀察各組家兔不同時間消化道內(nèi)胃、小腸、結(jié)腸內(nèi)FITC標記微球分布情況

2.3 腹部推拿對便秘型IBS模型家兔消化道內(nèi)FITC標記微球分布的影響

圖2示，分別測定家兔插管灌胃后16 h和24 h后在胃腸道的分布情況。在家兔插管灌胃16 h后，空白對照組家兔FITC標記微球主要分布在小腸，結(jié)腸有很少熒光強度的微球；而模型對照組主要分布在胃部，小腸和結(jié)腸有很少熒光強度，而腹部推拿組家兔結(jié)腸熒光強度增強。24 h后熒光強度示，空白對照組結(jié)腸部位有一定強度的熒光，胃部熒光較少，模型對照組胃部有少量熒光，小腸和結(jié)腸有一定強度的熒光；而腹部推拿后家兔結(jié)腸熒光明顯增強，與16 h結(jié)果相似。

2.4 腹部推拿對便秘型IBS模型家兔ENS-ICC結(jié)構(gòu)中C-Kit和nNOS表達的影響

圖3示，相對于空白對照組，模型對照組C-Kit和nNOS的表達明顯減少且形態(tài)不明顯；經(jīng)腹部推拿后，C-Kit和nNOS的表達明顯增加且形態(tài)明顯。

注：a.空白對照組；b.模型對照組；c.腹部推拿組圖3 免疫熒光染色觀察各組家兔結(jié)腸組織中ENS-ICC結(jié)構(gòu)中C-Kit和nNOS表達

2.5 腹部推拿對便秘型IBS模型家兔ENS-ICC-SMC超微結(jié)構(gòu)的影響

圖4示，空白對照組ICC細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，呈長梭狀，核膜完整，胞質(zhì)中有大量線粒體。SMC形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，核膜完整，能看到豐富的細胞器，如線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。相鄰ICC之間連接緊密，ICC與周圍SMC形成緊密的縫隙連接。而模型對照組ICC細胞形態(tài)較模糊，有一個長突起，胞質(zhì)較少，SMC核體較小，核膜尚完整，可見有腫脹的線粒體，與周圍細胞連接松散，ICC與周圍SMC之間連接松散，未見有縫隙樣連接。經(jīng)腹部推拿干預(yù)后，ICC細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，呈長梭狀，核膜完整，胞質(zhì)中能看到線粒體。SMC形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，核膜完整。ICC與周圍SMC形成緊密的縫隙連接，與鄰近神經(jīng)纖維末梢形成突觸樣連接，ENS-ICC-SMC結(jié)構(gòu)完整。

注：a.空白對照組；b.模型對照組；c.腹部推拿組圖4 投射掃描電鏡分析各組家兔結(jié)腸組織中ENS-ICC-SMC超微結(jié)構(gòu)比較

3 討論

IBS因其臨床癥狀復(fù)雜，潛在發(fā)病機制尚不明確，當(dāng)前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對其臨床治療乏善可陳，尚無治愈該病的手段，改善癥狀的藥物和非藥物治療方案的臨床療效亦有待確定。目前對于該病的病理研究表明，其發(fā)病與ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)有密切關(guān)系。

ENS作為胃腸道內(nèi)由興奮性神經(jīng)元和抑制性神經(jīng)元組成的神經(jīng)節(jié)，其神經(jīng)元與神經(jīng)纖維的數(shù)量、形態(tài)是維系胃腸道調(diào)節(jié)功能正常的基礎(chǔ)。ENS損傷、變性、缺失會引起腸道運動、分泌功能異常[5]。同時ENS與作為腸道起搏細胞的ICC緊密伴隨，對胃腸功能進行局部調(diào)節(jié)，是調(diào)節(jié)腸道動力的重要因素[6]。ICC作為一種非神經(jīng)細胞，大量研究證實ICC數(shù)量和形態(tài)異常對動力障礙性疾病(如胃排空異常、慢傳輸型便秘、Oddi括約肌功能障礙和其他胃腸動力障礙相關(guān)疾病)有很大影響[7]，同時與神經(jīng)活動有著特殊的連帶關(guān)系。其通過調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉信號傳遞，改變胃腸道的蠕動功能。SMC作為調(diào)控腸動力的另一關(guān)鍵性因素，其發(fā)揮作用主要由離子通道的激活來控制平滑肌細胞收縮等許多生理過程。

腸動力的正常運轉(zhuǎn)離不開ENS、ICC和SMC三者構(gòu)成的ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、介導(dǎo)、傳遞等一系列反應(yīng)，最后產(chǎn)生結(jié)腸蠕動的機械效應(yīng)。因此，ENS-ICC-SMC結(jié)構(gòu)中發(fā)生病變或破壞將導(dǎo)致腸動力功能紊亂。

推拿手法直接作用于人體，以力為作用特征。在手法作用力下，產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)換和生物電等信息傳導(dǎo)，進而刺激機體產(chǎn)生各種生物學(xué)效應(yīng)。已證實外界機械力可以引起細胞生物力學(xué)環(huán)境改變，產(chǎn)生的機械應(yīng)力可改變細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)，同時還能調(diào)控細胞的功能狀態(tài)，影響細胞的增殖、分化[8-10]。當(dāng)手法作用于腹部時，力以機械波的形式傳入細胞，在細胞質(zhì)或細胞核的效應(yīng)部位(如核糖體、線粒體)轉(zhuǎn)變?yōu)樯镄?yīng)，其作用可引起細胞形貌的改變；機械力信號也可能轉(zhuǎn)變成生物信號的過程引起細胞的生化和生理應(yīng)答[11]，可能影響ICC、腸神經(jīng)元、腸平滑肌細胞的增殖和凋亡。

本研究綜合應(yīng)用分子生物學(xué)、透射電鏡等現(xiàn)代多學(xué)科的研究技術(shù)，對腸動力障礙兔結(jié)腸組織中ENS變化及ICC和SMC網(wǎng)絡(luò)超微結(jié)構(gòu)觀察分析，說明腹部推拿可干預(yù)消化道動力產(chǎn)生與調(diào)節(jié)的基本功能單位，其調(diào)節(jié)IBS胃腸動力障礙的作用可能與其對腸ENS-ICC-SMC結(jié)構(gòu)的影響有關(guān)，在一定程度上揭示其防治腸動力障礙性胃腸病的作用機制。

中醫(yī)認為腹部居人體之中，為上下聯(lián)結(jié)的樞紐。《厘正按摩要術(shù)》曰：“胸腹者，五臟六腑之宮城，陰陽氣血之發(fā)源，若欲知其臟腑何如，則莫如診胸腹。[12]”五臟六腑尤以脾胃在腹部推拿中具有重要的地位，這與其所處的位置和生理作用密切相關(guān)，也是腹部推拿治療消化系統(tǒng)疾病的原理所在。盡管從中醫(yī)角度采用腹部推拿治療臟腑疾病，尤其是腸動力障礙引發(fā)的功能性胃腸病具備一定理論基礎(chǔ)，但其現(xiàn)代醫(yī)學(xué)作用機制的研究尚處于初級階段且尚未明確。因此，進一步闡明腹部推拿治療腸動力障礙引起的功能性胃腸病的作用機制，有助于提高其臨床應(yīng)用水平，對于深化腹部推拿基礎(chǔ)研究、促進推拿學(xué)科發(fā)展具有重要意義。