高鹽稀態醬醪中耐鹽生香酵母的篩選及生香特性研究

彭東，蔣雪薇,2*，陳幽，陳進，張偉，周慧,2，吳燦，方勤軍

1(長沙理工大學 化學與食品工程學院，湖南 長沙，410114) 2(湖南省調味品發酵工程技術研究中心，湖南 長沙，410600) 3(加加食品集團股份有限公司，湖南 長沙，410600)

醬油是經微生物發酵而成的一種傳統調味品，因其獨特的風味而廣受消費者的喜愛[1]。醬油釀造工藝在我國主要有低鹽固態發酵、傳統高鹽稀態發酵(曬露法)及現代高鹽稀態發酵3種方式[2]。近年來，國內大型企業大多采用現代高鹽稀態發酵工藝，但該工藝采用的封閉式發酵在減少醬油污染菌的同時，也減少了一些有利于醬油的風味菌，導致醬油風味物質不足。因此，要想在封閉發酵系統及較高鹽濃度下獲得風味上乘的釀造醬油，加快選育高耐鹽的風味菌是最主要的解決途徑。

生香酵母是一類以代謝合成酯類物質為主，同時還能促進醇、醛、酚等揮發性風味物質產生的酵母菌[3-4]。國內的生香酵母最早應用于白酒以彌補酒香的不濃郁，隨后擴展到醬油[5]、黃酒[6]、面包[7]及果醋[8]等發酵食品中應用。目前應用于醬油增香的酵母菌主要包括魯氏酵母(S酵母)、球擬酵母(T酵母)以及部分假絲酵母屬(C酵母)[5]，而對其他種屬酵母菌的研究還相對較少。因此，篩選醬油釀造生香酵母，研究其生香特性及應用成為醬油釀造微生物的重要研究方向之一。本文從高鹽稀態醬醪中篩選出生香優良的耐高鹽酵母，添加于高鹽稀態醬醪中，通過分析它們產生的揮發性風味物質種類及含量來研究生香特性，有利于增加醬油釀造酵母的菌種資源，為高鹽稀態醬油釀造工藝提供優質的發酵菌種，同時為解析高鹽環境中酵母的生香機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高鹽稀態醬醪，取自于湖南某醬油廠；黃豆芽，市售；三丁酸甘油酯(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；2-甲基-3-庚酮(內標物，99.5%，色譜純)，德國Dr.Ehrenstorfer公司；酵母基因組DNA提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；TaqDNA聚合酶，上海生工生物工程有限公司。

1.2 培養基

豆芽汁培養基[9]。

透明圈篩選培養基：酵母膏10 g，三丁酸甘油酯4 mL，NaCl 100 g，瓊脂粉2 g，加入1 000 mL蒸餾水，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

1.3 儀器與設備

ARZ-200游標卡尺，青島美吉特精密儀器工具有限公司；UV1800紫外可見分光光度計，日本島津公司；ZWY-2102C恒溫振蕩培養箱，上海智城分析儀器制造有限公司；VERITIPCR擴增儀，美國ABI公司；YRE2000B旋轉蒸發儀，鞏義市予華儀器有限責任公司；436 GC/EVOQ TQ/PAL氣質聯用儀，美國布魯克科技有限公司；Rxi-5Sil MS色譜柱，美國Restek公司；65 μm PDMS/DVB固相微萃取針，美國Supelco公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 耐鹽酵母的分離純化

將高鹽稀態醬醪樣品進行梯度稀釋后，吸取0.1 mL(10-4、10-5、10-6樣品稀釋液)涂布于含100 g/L NaCl的豆芽汁培養基中，每個梯度進行3個重復實驗，28 ℃培養2～3 d，挑選疑似酵母菌的單菌落進行鏡檢，將初步鏡檢結果為酵母菌的菌株在含100 g/L NaCl的豆芽汁平板上進一步分離純化獲得純培養菌株。

1.4.2 產酯酵母的篩選

1.4.2.1 透明圈法初篩

將初篩得到的酵母菌采用點種的方式接種于透明圈篩選培養基中，28 ℃培養2～3 d觀察產生的變色圈現象，使用游標卡尺精確測量透明圈直徑D及菌落直徑d，并計算D/d，每個菌進行3個平行實驗。

1.4.2.2 產酯能力復篩

將初篩得到的酵母菌取1 mL 108CFU/mL接種于100 mL含100 g/L NaCl的豆芽汁液體培養基中，在28 ℃培養箱中靜置培養7 d，再將培養的菌體培養液利用旋轉蒸發儀在60 ℃下蒸餾30 min得到菌體培養液餾分，用回流皂化法[10]測其中的總酯含量，每個菌進行3個平行實驗，篩選出總酯積累量高的菌株。

1.4.3 耐鹽產酯酵母的鑒定

1.4.3.1 耐鹽產酯酵母的生理生化特性

將復篩得到的酵母菌進行糖發酵實驗、碳/氮源同化實驗、產類淀粉實驗及產脲酶實驗，具體參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[11]。

1.4.3.2 耐鹽產酯酵母的26S rDNA序列分析

采用酵母基因組DNA提取試劑盒提取酵母菌模板DNA，進行PCR。PCR擴增：使用酵母菌的通用引物(NL1：5’-GCATATCAATAAGCGGAAAAG-3’；NL4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)；采用50 μL的PCR反應體系：2 μL模板DNA，2 μL NL1，2 μL NL4，5 μL 10×PCR Buffer，3 μL Mg2+(25 mol/L)，1 μL dNTP(10 mol/L)，1 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)，ddH2O補齊至50 μL；PCR反應條件基于高潔等[12]的方法并進行了優化。具體為：95 ℃預熱1 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35個循環后72 ℃末端延伸7 min，4 ℃保存。PCR擴增產物以1%瓊脂糖凝膠檢測。

測序由生工生物工程(上海)股份有限公司武漢分公司完成。測序結果在NCBI庫進行同源性比對，并通過MEGA X軟件構建系統發育樹。

1.4.4 菌種性能測試

將鑒定的酵母菌分別接種于含100、160 g/L NaCl的豆芽汁液體培養基中，在28 ℃、180 r/min下培養48 h，在0～48 h內每隔4 h取樣測OD570值，繪制生長曲線，并在48 h時取樣倒平板計算活菌數。在28 ℃培養箱中靜置培養7 d，使用回流皂化法測定總酯含量。

1.4.5 生香特性分析

1.4.5.1 感官分析

將所分離鑒定的酵母菌接種于160 g/L NaCl豆芽汁液體培養基中，于28 ℃、180 r/min條件下培養7 d，感官評定實驗嗅聞其香氣[13]。

1.4.5.2 高鹽稀態醬醪發酵工藝

將500 g成品曲與1 L鹽水(230 g/L NaCl)混合，置于28 ℃下恒溫發酵。將3種酵母制備成107CFU/mL的菌懸液，采用高鹽稀態醬醪發酵，第30天分別加入5 mL 3株酵母的菌懸液，繼續發酵30 d，總發酵周期為60 d，對照組為未添加酵母發酵的醬醪。在發酵結束后通過壓榨醬醪獲得醬油。

1.4.5.3 SPME-GC-MS分析

固相微萃取(solid-phase micro extraction, SPME)：取壓榨醬油，添加5 μL質量濃度為0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮甲醇溶液作為內標物[14]，總體積為2 mL，在50 ℃下加熱振蕩25 min，吸附20 min后進樣；GC條件：進樣口溫度250 ℃，程序升溫，40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min，載氣為高純He，流速為1.0 mL/min，分流比為10∶1；MS條件：EI離子源。電子能量70 eV，發射電流200 μA，離子源和傳輸線溫度為250 ℃，質量掃描范圍m/z30～500。揮發性化合物定性分析[15]：采用NIST14譜庫進行檢索比對樣品中所含化合物，再與保留時間、標準質譜比對來確定化合物結構。

揮發性化合物半定量按公式(1)計算[16]：

(1)

式中：C1，揮發性化合物濃度；C2，內標物濃度；A1，揮發性化合物峰面積；A2，內標物峰面積。

1.5 數據處理

利用SPSS 22軟件進行方差分析，并通過多重字母標記法(Duncan’s)進行顯著性差異分析(P<0.05)[17]、Origin 9.0進行數據可視化處理。

2 結果與分析

2.1 耐鹽酵母的分離純化

高鹽稀態醬醪中存在一些天然接種的酵母，因長期在高鹽環境下生長，具有了較好的耐鹽能力，選擇高鹽稀態醬醪，采樣分離耐鹽酵母，在豆芽汁平板上挑選典型酵母菌單菌落進行分離純化，得到3種形態的酵母菌34株，將其命名為CS2.20～CS2.53，其菌落及菌體形態見圖1。

圖1 三種酵母菌的菌落及菌體形態(40×16)

圖1-a中的酵母菌菌落為乳白色、邊緣整齊、呈圓形、較厚、不透明，表面較濕潤，菌體形態為橢圓形，芽殖，無假菌絲；圖1-b中的酵母菌落為乳白色、邊緣整齊、呈圓形、較厚、不透明，表面較粗糙，橢圓形菌體，芽殖，無假菌絲；圖1-c中的酵母菌落為乳白色、邊緣整齊、呈圓形、較厚、不透明，表面較濕潤，橢圓形菌體，芽殖，有假菌絲。

2.2 耐鹽產酯酵母的篩選

酯類物質在微生物細胞中主要由酯化反應產生，其關鍵酶為酯化酶，酯化酶活力大小能反映其合成酯類物質能力[18]。酯化酶是一種同工酶，既能催化酸和醇合成酯，也能水解酯形成酸和醇[19]，因此，可以利用酵母菌產生的酯酶水解三丁酸甘油酯形成的透明圈[20]與菌落直徑比(D/d)值大小來判斷其酯酶活力。在圖2-a中，D/d>2.0的酵母菌有5株，為CS2.23、CS2.30、CS2.31、CS2.42及CS2.53，D/d分別為2.1、2.5、2.5、3.0及2.6。總酯是耐鹽酵母在生長代謝中產生酯類物質的總量，是判斷生香酵母產香能力的重要指標[21]。在圖2-b中，總酯含量>1.00 g/L的酵母菌一共有4株，包括CS2.23、CS2.24、CS.2.42及CS2.53，酯含量分別為1.18、1.16、1.51及1.46 g/L。

a-耐鹽產酯酵母的D/d值;b-耐鹽產酯酵母的總酯含量

透明圈菌落直徑比(D/d)值的大小能較好地反映菌株的酯化酶活力，通過透明圈法初篩的5株菌中的3株菌，液體發酵條件下總酯積累量高，因此，在篩選量較大的情況下，透明圈法能比較準確地初篩獲得產酯良好的菌株。酯化酶催化的酯化反應是酵母菌中合成酯類物質的重要途徑，但這條途徑合成速率較慢，故透明圈法初篩的菌株需進一步驗證其產酯能力。總酯則能直觀反映酵母菌利用所有途徑獲得的產酯量，但培養體系中的營養物質對產酯有較大的影響。醬油發酵體系中的營養物質較豆芽汁培養基豐富，且發酵時間相對長，故選擇酯化酶活力和總酯測量值均較高的酵母菌CS2.23、CS2.42、CS2.53進行生香特性研究。

2.3 耐鹽產酯酵母的鑒定

如圖3-a所示，3株菌的擴增條帶分離明顯無拖尾，長度在600 bp左右。將篩選得到的3株菌的PCR產物進行26S rDNA序列分析，構建系統發育樹，見圖3-b。

a-26S rDNA 凝膠電泳圖;b-系統發育樹

為了更加準確地判斷3株酵母菌的種屬，對3株菌的生理生化特性進行研究，結果如表1所示。從表1可以看出，CS2.23、CS2.53只能利用葡萄糖，CS2.42能利用葡萄糖、麥芽糖；CS2.23不能同化山梨糖、海藻糖、乳糖及可溶性淀粉，CS2.42不能同化乳糖、可溶性淀粉及檸檬酸，CS2.53不能同化乳糖；CS2.23、CS2.53均能利用KNO3和NH4NO3兩種氮源，CS2.42只能利用KNO3；3株菌均不能產生類淀粉及脲酶。參考《酵母菌的特征及鑒定手冊》分析生理生化特性，根據NCBI比對的結果最終判斷CS2.23為粉狀畢赤酵母(Millerozymafarinosa)、CS2.42為魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、CS2.53為近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)。

表1 三株酵母菌的生理生化特性

2.4 耐鹽產酯酵母的菌種性能研究

耐鹽產酯酵母在高鹽下能正常生長是其能在高鹽稀態醬醪發酵中應用的基本前提。高鹽稀態醬醪發酵中，NaCl質量濃度一般在160 g/L左右，隨著人們對健康越來越重視，100～120 g/L NaCl的減鹽發酵成為當前的關注熱點。對3株菌在高鹽(160 g/L NaCl)和低鹽(100 g/L NaCl)環境下的菌種性能進行考察，結果見圖4。在圖4-a中隨著NaCl濃度的提高，3株菌的生長能力有所下降，菌株CS2.23的OD570下降6.4%，CS2.42下降9.05%，CS2.53下降14.47%，但仍然保持較好的生長特性；不同鹽濃度下3株菌的生長趨勢比較接近，對數生長期的起始時間由低鹽培養的4 h推遲到高鹽培養的12 h，醬油的高鹽稀態發酵周期一般為6個月，3株菌進入對數期延緩的8 h對于長周期的醬油發酵不會產生影響。在圖4-b中隨著NaCl濃度提高，3株菌的活菌數有所下降，在高鹽環境下3株菌的活菌數均維持在106CFU/mL左右，說明其在高鹽環境均具有較好的繁殖能力，能獲得≥106CFU/mL的活菌進行醬醪發酵。在圖4-c中隨著NaCl濃度提高，3株菌的總酯好了呈下降趨勢，總酯含量與活菌數量呈正相關，說明菌株的生長能力影響了菌株的代謝產酯能力；在高鹽環境下3株菌的總酯含量下降了0.5 g/L左右，但均在0.7 g/L以上，仍具有較好的產酯能力，適合進一步應用于高鹽稀態醬醪發酵。

a-不同NaCl質量濃度下的酵母菌生長曲線;b-不同NaCl質量濃度下的活菌數;c-不同NaCl質量濃度下的總酯含量

2.5 耐鹽產酯酵母生香特性研究

菌種產酯能力強并不能說明其在發酵過程中能增香，因此，在進行高鹽稀態醬醪發酵前，有必要對菌種發酵液的香氣進行初步的嗅聞分析。為縮短發酵時間，采用160 g/L NaCl豆芽汁液體培養基搖瓶培養所篩選的3株菌，經嗅聞測試發現3株菌均無不良氣味，且CS.23具有水果香、麥芽香，CS2.42具有濃郁的水果香、玫瑰花香，CS2.53具有水果香，適合進一步用于醬油釀造分析。為了進一步探明3株菌的香氣成分及濃度，將這3株菌添加至高鹽稀態醬醪發酵，共檢測出46種揮發性風味物質(表2)。添加CS2.23、CS2.42及CS2.53發酵的醬油中揮發性風味物質總含量較對照組分別提高了81.30%、140.00%及87.87%，均有較大提升，說明3株酵母可作為醬油釀造生香酵母使用。但3株菌產生的揮發性風味物質含量還存在較大的差異，故而出現了香氣嗅聞結果不同的現象。

表2 三株酵母菌發酵醬油的揮發性風味物質分析

續表2

酯類物質是醬油中關鍵的一類揮發性風味物質，主要由生香酵母產生的酶催化前體物質合成[29]。從表2可知，添加3株菌的發酵醬油中一共定量檢出17種酯類物質，在添加菌株CS2.23、CS2.42及CS2.53的發酵醬油中數量分別為12、15及16種，較對照組分別增加了3、6及7種，而相應的含量也比對照組提高了188.60%、296.13%及226.87%。揮發性酯類物質總含量排序為CS2.42>CS2.53>CS2.23，這與總酯測量值排序結果一致，說明3株菌所積累的揮發性酯類物質含量與總酯含量呈正相關的關系。因此，添加生香酵母發酵可以通過增加酯類物質的數量及含量提升醬油香氣成分的豐富度。在添加3株菌發酵醬油檢出的酯類物質中，最多的是乙酯類(13種)，這可能是由于3株菌具備較好產乙醇能力，在發酵后期，乙醇進一步與有機酸經酯酶催化合成乙酯所致。所檢出的乙酯類物質主要是具有水果香的乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯，具有甜奶油香的乳酸乙酯，花果香的月桂酸乙酯及蠟香的棕櫚酸乙酯等，它們給醬油提供了前香、主體香及尾香的物質構成。乙酯類物質中含量增加最明顯的是乙酸乙酯，在添加生香酵母CS2.23、CS2.42及CS2.53的發酵醬油中含量分別比對照組提高了387.60%、533.84%及465.01%，這為其發酵醬油前香及主體香的構成奠定了重要的物質基礎，乙酸乙酯也成為添加3株菌在酯類物質風味特征上的重要成分。除此以外，3株菌發酵醬油中還檢測到2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、苯甲酸乙酯及14-甲基十五烷酸甲酯，這些物質在對照組中未檢出，為3株菌形成特色的酯類香氣提供了基礎。

醇、醛、酚是除酯類物質之外比較重要的幾類揮發性風味物質。醇類物質主要由酵母菌經糖酵解或Enrlich途徑產生[30]，是醬油中醇香風味的來源、同時為酯類物質的形成提供物質基礎。添加菌株CS2.23、CS2.42及CS2.53的發酵醬油中分別定量檢出醇類物質7、8及7種，與對照組(7種)在數量上無明顯差異，但含量有較大的提升，分別較對照組提升了91.55%、163.04%及87.19%。添加3株菌的發酵醬油中，乙醇均比對照組有明顯提升，乙醇是醬油醇香的主要來源，也是形成乙酯的重要物質，其構成了醬油的基礎香氣。添加CS2.23的發酵醬油中3-甲基-1-丁醇及2,3-丁二醇含量是3株菌中最高的，且較對照組提升明顯；3-甲基-1-丁醇具有麥芽香，能賦予醬油香氣的濃郁感；2,3-丁二醇具有水果香，能氧化生成乙偶姻，進一步生成吡嗪類物質，形成醬油的焦香。添加CS2.42的發酵醬油中除乙醇外，1-辛烯-3-醇及苯乙醇含量是3株菌中最高的，且較對照組提升明顯；1-辛烯-3-醇具有蘑菇香，除增加醬油香氣的濃郁感外還賦予醬油鮮香醇厚感；苯乙醇具有玫瑰花香，是中國醬油典型的香氣成分。添加CS2.53的發酵醬油中除乙醇外，比較典型的香氣物質是1-辛烯-3-醇，其含量較對照組也有比較明顯地提升。醛類物質主要來源于氨基酸的降解和微生物的發酵轉化，具有調和香氣的作用[31]。表2顯示，一共檢測出5種醛類物質，添加3株菌的發酵醬油中醛類物質含量較對照組有一定的提升，其中添加CS2.42的發酵醬油中具有水果香的苯乙醛含量在3株菌種最高，較對照組提升了44.21%；另外，添加CS2.53的發酵醬油中檢出了少量具有玫瑰香的壬醛。酚類物質一共檢測出4種，添加CS2.53的發酵醬油中酚類物質數量及含量均為3株菌中最高，其特征香氣物質為4-乙基愈創木酚及4-乙烯基愈創木酚，其中4-乙基愈創木酚在其他組中未檢出，4-乙烯基愈創木酚含量較對照組提升了136.56%。酮類、酸類、含硫化合物和其他類物質在3株菌及對照組發酵醬油中的種類和含量變化不大，表明篩選得到的3株菌對這幾類揮發性物質的影響較小。

從3株菌液體發酵后的嗅聞試驗結果結合SPME-GC-MS分析可知，CS2.23發酵具有水果香及麥芽香，是由于CS2.23在發酵中產生了水果香的乙酸乙酯及麥芽香的3-甲基-1-丁醇為主的特征香氣物質；CS2.42發酵具有濃郁的水果香、玫瑰花香則是由于其發酵產生了乙酸乙酯、苯乙醇、1-辛烯-3-醇及苯乙醛為主的特征香氣物質，其中乙酸乙酯及苯乙醛貢獻了水果香，苯乙醇貢獻了玫瑰花香，而1-辛烯-3-醇則形成了濃郁感；CS2.53發酵的特征香氣物質為乙酸乙酯、4-乙基愈創木酚及4-乙烯基愈創木酚，形成的風味也是水果香為主風味。3株菌的主要特征香氣物質均有乙酸乙酯，因其風味閾值較低(5.00 μg/L)，故其發酵的嗅聞特征表現出水果香為基礎香氣，其他特征香氣物質的存在形成了3株菌在香氣總體特征上的差異，而揮發性風味物質數量及含量較對照組的明顯增加則構成了醬油香氣的豐富度及醇厚感。

3 結論

本研究從高鹽稀態醬醪中篩選獲得3株生香優良的酵母菌CS2.23(M.farinosa)、CS2.42(Z.rouxii)、CS2.53(C.parapsilosis)。研究菌種性能發現，3株菌在160 g/L NaCl質量濃度下生長良好，具有較好的繁殖能力及產總酯能力；3株菌具有不同的生香物質基礎，進而形成了不同的香氣特性，酯類揮發性風味物質的含量較對照組有明顯的提高，且醇類、醛類及酚類等其他類揮發性風味物質也有一定的提升。研究顯示，分離自高鹽稀態醬醪的3株耐鹽生香酵母有不同的產酯生香特性，具備醬油釀造生香酵母的開發潛力。