丹皮酚對脂多糖刺激的RAW264.7細胞炎癥與自噬的影響?

張超穎，苗紀飛，劉 霞，許 沁，葉 森，溫 泉，梅麗艷，葉 芃，李 春，黎 暉△

(1. 廣州中醫藥大學，廣州 510006； 2. 貴州中醫藥大學，貴陽 550025)

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是一種最常見的內毒素，是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜結構的重要組成成分，在人體內革蘭氏陰性菌感染引起的細菌毒性反應中，作為內毒素可以刺激免疫炎癥反應。LPS處理巨噬細胞系RAW264.7是一種常用的模擬內毒素刺激免疫細胞炎癥反應的細胞模型[1]。自噬是指細胞受到信號誘導后在細胞內產生膜，膜包裹部分細胞質與需要降解的細胞器及蛋白質融合形成自噬體(Autophagosome)，最后與溶酶體結合形成自噬溶酶體(Autolysosome)降解其所包含的內容物的過程[2]，其與細胞的增殖、分化、凋亡等活動有關并影響細胞的生理功能。雷帕霉素可以刺激巨噬細胞內自噬流蛋白活性，加速巨噬細胞對病原體的清除。如果巨噬細胞活性降低則自噬活動降低，細菌不能很快地清除導致感染持續發生。炎癥細胞因子可以促進巨噬細胞活性增加，促進自噬從而清除病原體，但過多的炎癥細胞因子導致炎癥風暴則嚴重損害機體，丹皮酚和雷帕霉素聯合使用則可以促進自噬，清除病原體，同時減少炎癥風暴的發生。LPS刺激免疫細胞產生的白介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)等炎性因子，可以誘導巨噬細胞自噬活性，參與調控炎癥反應和免疫應答[3]。

丹皮酚是從毛茛科芍藥屬植物芍藥、牡丹的根皮以及蘿藦科植物干燥根或全草中提取出的活性成分[4]。既往研究表明，丹皮酚能夠對LPS誘導小鼠單核巨噬細胞RAW264.7產生的炎性因子有廣泛的抑制作用[5-6]。本實驗以 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞為主要模型，以自噬誘導劑雷帕霉素促進自噬，研究丹皮酚對RAW264.7自噬與免疫功能的影響，探索丹皮等中藥調控固有免疫反應的分子機制。

1 材料

1.1 藥物與試劑

丹皮酚購自廣州市藥檢所；雷帕霉素(553211)、LPS(L4391)均購自Sigma公司； Anti-GAPDH抗體(BM3896)購自武漢博士德生物公司；Anti-LC3B(abcam243506)、Anti-p62(abcam56416)、Anti-TNF-α(abcam9579)、Anti-IL-1β(abcam156791)、Anti-Beclin(abcam114071)、Anti-Cy3(abcam 97035)、熒光染料DAPI(abcam104139)等均購自美國abcam公司；DMEM 高糖培養基(11965092)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，10270-106)均購自Gibco。

1.2 細胞株

小鼠單核巨噬細胞株 RAW264.7 購自中國科學院上海細胞庫。

1.3 儀器

超凈臺(蘇州凈化設備有限公司)；CO2培養箱(德國 Heraeus公司)；GL-16G型離心機(上海安亭公司)；XDS-1B 型倒置顯微鏡(重慶光電公司)；制冰機(Scotsman 思科特曼)；低溫離心機 Labogene 低溫超速離心機(德國 Eppendorf 公司)；酶標儀(瑞典TECAN公司)。電泳儀(BIO-RAD)；轉膜儀(BIO-RAD)；全自動化學發光圖像分析儀(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 細胞培養與處理

表1示，RAW264.7細胞在含10%胎牛血清的新鮮高糖DMEM完全培養基，5% CO2，37 ℃恒溫，飽和濕度的細胞培養箱中孵育培養。根據細胞的生長情況，2～3 d換液1次，待細胞密度達80%左右按1∶3 傳代。取對數生長期RAW264.7細胞，將細胞按1×105/孔接種于對應容器中，培養24 h后將培養基按分組更換為含藥物的無血清培養基，作用24 h后分別收集上清和細胞進行檢測。

表1 實驗分組及加藥情況比較

2.2 蛋白免疫印跡法(western blot，WB)檢測自噬相關蛋白與炎癥因子表達

按照表1的分組進行藥物處理24 h后，收集細胞提取總蛋白，BCA 法進行蛋白定量。每組樣品總蛋白20μg 經 12% SDS-PAGE電泳分離后轉移至PVDF膜，封閉后分別加入一抗，LC3B(抗體濃度比為1∶1000)、Beclin(抗體濃度比為1∶1000)、P62(抗體濃度比為1∶1000)、TNF-α(抗體濃度比為1∶1000)、IL-1β(抗體濃度比為1∶1000)及內參GAPDH(抗體濃度比為1∶1000)，二抗為辣根過氧化物酶標記的IgG(抗體濃度比為1∶1000)；使用ECL發光液顯影后，根據各組灰度值結果進行分析。

2.3 激光共聚焦熒光共定位法(Immunofluo-rescence，IF)檢測自噬相關因子LC3B、P62的定位與表達

按照表1的分組進行藥物處理24 h后取出細胞，用預冷的PBS 漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，每次5 min，用0.5% Tritons透膜，PBS漂洗3次，5%BSA室溫封閉1 h后，同時加入2種一抗，LC3B(抗體濃度比為1∶500)和P62(抗體濃度為1∶1000)4 ℃ 孵育過夜。PBS洗掉多余一抗后，用熒光二抗cy3(抗體濃度比為1∶1000)、FITC(抗體濃度比為1∶1000)室溫避光孵育1 h，PBS洗掉多余熒光二抗后，DAPI(抗體濃度比為1∶1000)染核，室溫10 min，PBS洗掉多余DAPI后封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬相關蛋白LC3B與P62的定位表達。

2.4 酶聯免疫分析(enzyme-linked immunosor-bent assay，ELISA)檢測炎癥因子TNF-α的分泌

按照表1的分組進行藥物處理24 h后，收集細胞培養上清。設置7個標準品，將不同濃度標準品和實驗樣本每孔100 μL加入到96孔板中，37 ℃孵育60 min，洗滌5次，每次震蕩或靜置40 s。每孔加入100 μL抗體工作液，37 ℃孵育30 min，洗滌5次。每孔再加入100 μL酶結合物工作液，37 ℃孵育30 min，洗滌5次。最后每孔加入100 μL顯色底物工作液，37 ℃孵育15 min后加入 100 μL終止液混勻。使用酶標儀測量吸光度，通過樣本的OD值計算炎癥因子濃度。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 丹皮酚對LPS刺激RAW264.7細胞后自噬相關因子LC3B、Beclin、P62表達的影響

圖1示，WB實驗結果如圖1A、1B，統計分析結果如圖1C、1D、1E、1F。

與正常組比較，RAW264.7細胞經LPS刺激之后，LPS組LC3B和Beclin表達量差異無統計學意義，LC3B-I向LC3B-II的轉化也沒有顯著性差異，LPS不能增強LC3B表達，提示LPS不影響細胞自噬；RAP組出現了顯著性差異，LC3B表達顯著增加，LC3B-l向LC3B-ll轉換率顯著增加，提示RAP可以增強細胞自噬活性。

與LPS組比較，在L+R組 LC3B表達增強，差異有統計學意義；Beclin表達呈增強趨勢，P62表達呈減少趨勢，LC3B-l向LC3B-ll轉換增強，差異有統計學意義；L+P組LC3B與Beclin表達呈現增強趨勢，提示雷帕霉素和丹皮酚均可以增強LPS刺激條件下的自噬活性。

與RAP組比較，R+P組LC3B、Beclin表達減少，差異無統計學意義。但是我們依然可以看到表達減少的趨勢，提示丹皮酚能夠在自噬表達顯著增高時抑制自噬。

注：L 代表LPS，R 代表雷帕霉素，P 代表丹皮酚；A:WB結果；B:LC3B/GAPDH統計結果；C:LC3B-II/LC3B-I統計結果；D: Beclin/GAPDH統計結果；E.WB結果；F.P62/GAPDH統計結果與對照組比較：*P<0.05；與對照組比較：** P<0.01； 與L+R組比較：▲P<0.05；與LPS組比較：#P<0.05圖1 LPS刺激RAW264.7細胞中自噬相關蛋白LC3B、Beclin、P62的表達

3.2 丹皮酚對LPS刺激RAW264.7細胞自噬相關因子LC3B、P62熒光表達與定位

圖2示，在正常對照組中， Cy3 標記的 LC3B(紅色)主要定位于細胞核與細胞質中，與 DAPI 標記的細胞核重疊，FITC標記的P62(綠色)主要定位在細胞質中。經藥物刺激后，其定位并沒有改變。

圖2 LPS刺激的 RAW264.7 細胞中自噬相關因子LC3B和P62 的定位和表達(激光共聚焦×630倍)

3.3 丹皮酚對LPS刺激RAW264.7細胞炎癥相關因子TNF-α和IL-1β表達的影響

圖3、4示，WB實驗結果如圖3 A、3B，WB統計分析結果如圖3C、3D，Elisa統計分析結果如圖4。

與正常組比較，RAW264.7細胞經LPS刺激之后，LPS組TNF-α 總蛋白表達與細胞外分泌增多，IL-1β總蛋白表達增多，提示LPS激活RAW264.7細胞炎癥反應。Rap組和R+P組TNF-α總蛋白表達與細胞外分泌無明顯差異，IL-1β表達也無明顯差異，提示單純加入雷帕霉素對細胞并無影響。

與LPS組比較，L+R組、L+P組和 L+R+P組都呈現相同的作用趨勢，TNF-α 總蛋白表達減少，IL-1β總蛋白表達水平均下降，提示雷帕霉素與丹皮酚能夠抑制炎癥反應。與L+R組比較，L+R+P組TNF-α細胞外分泌減少，IL-1β總蛋白表達減少，提示雷帕霉素與丹皮酚聯合作用，其抑制炎癥效果增強。

與Rap組比較，R+P組表達量差異無統計學意義，提示在非炎癥的環境中，雷帕霉素與丹皮酚對細胞沒有影響。

注：L.LPS；R.雷帕霉素；P.丹皮酚；與對照組比較：*P<0.05；與LPS組比較：# P<0.05；與L+R組比較：▲▲▲ P<0.001圖3 LPS刺激RAW264.7細胞中TNF-α、IL-1β表達(Western blot)

注：L.LPS；R.雷帕霉素；P.丹皮酚；與對照組比較：*** P<0.001；與對照組比較：****P<0.0001；與LPS 組比較：#P<0.05；與LPS 組比較：##P<0.01；與LPS 組比較：#### P<0.0001；與L+R組比較：▲▲▲P<0.01圖4 LPS 刺激 RAW264.7 細胞中 TNF-α 的分泌(Elisa)

4 討論

自噬是一種細胞的自我降解、轉化和供能機制[7]。LC3B是自噬的標志性蛋白，在自噬發生時，LC3B-I在Atg5-Atg12-Atg16 復合物的幫助下連接上一個磷脂酰乙醇分子形成 LC3B-II。P62是自噬降解底物，對降解底物的識別和包裹起關鍵作用[8]。Beclin在哺乳動物細胞中過表達時促進細胞自噬[9]，表達隨著自噬的增強而增多，因此LC3B、Beclin和P62可以作為自噬的檢測指標。TNF-α 和IL-1β是炎癥反應的標志性炎癥因子[10-11]。有研究表明，血漿中 TNF-α、IL-1β含量與膿毒癥患者的病情及預后密切相關[12-13]。

有研究表明，丹皮酚能夠阻斷p38、ERK和NF-κB信號通路[14-15]，對LPS誘導巨噬細胞產生的炎性介質有廣泛的抑制作用[16-17]。還有研究發現，丹皮酚在HSE 模型中可抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的表達，調節 TNF-α 和 IL-6 的合成及分泌[18-19]。本研究發現，在LPS誘導RAW264.7細胞的炎癥環境條件中，丹皮酚與自噬激動劑雷帕霉素呈現相同的作用趨勢，兩者均能促進自嗜并抑制炎癥；當雷帕霉素與丹皮酚共同作用，使自噬增強，炎癥進一步減弱，對炎癥的抑制作用顯著強于單獨使用丹皮酚或者雷帕霉素。據此推測，丹皮酚通過促進自噬來抑制炎癥反應。在LPS誘導的炎癥環境中，丹皮酚激活自噬相關通路，調節自噬相關蛋白和炎癥因子，影響炎癥細胞的穩態，發揮抗炎作用。

丹皮酚所調控自噬與炎癥的相互作用機制影響著細胞功能，與炎癥相關的腫瘤、自身免疫性疾病和代謝性疾病等有著密切關系，對于感染性疾病的臨床防治可能有較重要的應用前景，為臨床的炎癥性疾病治療提供新思路，值得進一步深入研究。