酶法制備含ω-3多不飽和脂肪酸油脂的國際研究進展

Dilay Sen，Derya Kahveci

（土耳其伊斯坦布爾科技大學 化學與冶金工程學院 食品工程系，土耳其 伊斯坦布爾 34469）

多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）是一類重要的營養物質。根據靠近脂肪酸分子甲基端的第一個雙鍵的位置，多不飽和脂肪酸主要分為ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸。ω-3多不飽和脂肪酸主要是α-亞麻酸（α-linolenic acid，ALA，C18:3），ω-6多不飽和脂肪酸主要是亞油酸（linolenic acid，LA，C18:2）。這兩種脂肪酸（FAs）都不能在體內合成，因而是必需的營養物質，被稱為必需脂肪酸。ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸在代謝過程中使用相同的酶，因此，ALA和LA的相對含量會影響彼此的代謝效率[1]。

目前研究表明，ω-3多不飽和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA，C20:5）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA，C22:6）對人體健康有益。在成人體內只有不到8%的ALA轉化為EPA，而ALA向DHA的轉化則可忽略不計（＜0.02%～4%）。因此，EPA和DHA都應通過飲食攝入進行補充。ω-3多不飽和脂肪酸的主要來源是海產品，由浮游植物和藻類合成，經食物鏈進入魚類和海洋哺乳動物的脂質中[2]。為了充分發揮ω-3多不飽和脂肪酸對人體健康的益處，建議將此類必需脂肪酸引入食品和油脂中，而非食用魚類。Ward和Singh[3]指出，每天攝入1 g EPA和DHA需要食用60～135 g鮭魚，這引起了人們對富含ω-3多不飽和脂肪酸油脂的興趣。

可以通過化學酯交換或酶促酯交換的方法進行油脂改性，其工藝過程如圖1所示。由于ω-3多不飽和脂肪酸的高不飽和度，特別易于氧化，因此需要在高溫下進行的化學酯交換不適用于此類油脂。此外，ω-3多不飽和脂肪酸在甘油骨架上的位置對其在體內的消化吸收有重要影響。ω-3多不飽和脂肪酸位于甘油骨架的sn-2位上時可有效防止氧化[4]，而且以2-單酰基甘油（2-monoacylglycerol，2-MAG）的形式更利于吸收利用[5]。因此，具有特異選擇性的酶法酯交換更適合制備富含ω-3多不飽和脂肪酸的油脂。

本文將簡要介紹含ω-3多不飽和脂肪酸油脂的營養特性，并重點評述2015—2019年酶法制備含ω-3多不飽和脂肪酸油脂的國際研究進展。

圖1 化學酯交換和酶促酯交換反應過程流程圖（改編自參考文獻6）。

1 ω-3多不飽和脂肪酸的營養功效

20世紀70年代以來，研究發現格陵蘭愛斯基摩人的低冠心病發病率與他們對多脂魚類的高攝入量有關[7]，因此，人們開始關注ω-3多不飽和脂肪酸對健康的影響。ω-3多不飽和脂肪酸主要是通過改變細胞膜脂組成、細胞代謝、信號轉導和調控基因表達而發揮作用，它們可以調控肝臟、心臟、脂肪組織和大腦中的基因表達[8]。根據現有的研究，ω-3多不飽和脂肪酸在預防和治療心血管疾病、高血壓、糖尿病、關節炎和其它炎癥性及自身免疫性疾病和癌癥方面發揮著重要作用，對正常的生長發育，尤其是大腦和視網膜的生長發育至關重要。

1.1 對心血管疾病的功效

心血管疾病是所有影響心臟和循環系統的疾病的通稱。它是西方社會人群的主要死亡原因，并且與西方飲食中常見的高脂肪攝入，尤其是飽和脂肪的攝入有關。經常食用含ω-3多不飽和脂肪酸的魚或魚油可降低冠心病的發病率和死亡率[9]，這已被流行病學研究充分證實[10]，然而，為了預防心血管疾病而食用的ω-3多不飽和脂肪酸補充劑的作用，至今仍存在爭議[11]。研究表明，魚對心血管疾病風險的有益影響是源于魚體內營養物質的協同作用，而不僅僅是ω-3多不飽和脂肪酸的作用。

1.2 對癌癥的功效

癌癥一詞涵蓋了100多種疾病。ω-3多不飽和脂肪酸已被證實具有抗癌作用，特別是對乳腺癌[12]、結腸癌[13]和前列腺癌[14]。此外，ω-3多不飽和脂肪酸可能會增加腫瘤細胞對常規療法的敏感性，從而提升常規療法的功效，特別是對治療耐藥癌癥的療效[15]。

1.3 對糖尿病的功效

胰島素在細胞水平參與脂肪酸代謝的各個方面，這也與糖尿病相關。大量人群實驗的結果表明，ω-3多不飽和脂肪酸對高甘油三酯血癥具有積極作用且可改變膽固醇的分布，因此，建議對糖尿病患者使用ω-3多不飽和脂肪酸[16]。其中一個有趣的發現是，愛斯基摩人胰島素抵抗和葡萄糖不耐癥的發病率迅速增加，這與從食用含高ω-3多不飽和脂肪酸和低飽和脂肪酸（saturated FAs，SFA）的天然魚類和海洋哺乳動物轉變為食用低ω-3多不飽和脂肪酸和高飽和脂肪酸的食品有關[17]。

1.4 對炎癥性疾病的功效

炎癥是一系列急性和慢性人類疾病的組成部分，其特征是炎癥性細胞因子的產生。花生四烯酸（arachidonic acid，AA，C20:4）的衍生物類花生酸具有促炎效應。另一方面，ω-3多不飽和脂肪酸代謝產生了消炎介質[18-19]，稱為消退素、保護素和巨噬細胞消炎素。它們既有直接作用（例如，通過代替AA作為類花生酸底物并抑制AA代謝），又有間接作用（例如，通過影響轉錄因子激活改變炎癥基因的表達）[18，20-21]。此外，食用富油魚類也可有效預防兒童哮喘[22]。

1.5 對神經組織發育的功效

ω-3多不飽和脂肪酸，尤其是DHA，是人腦的重要組成部分，腦內約三分之一的脂質由ω-3多不飽和脂肪酸組成。大腦發育中DHA的減少與動物體內神經元再生的減少、神經遞質代謝的不足、學習和視覺功能以及運動技能的改變有關[23]。此外，流行病學研究表明，孕婦DHA水平低與其嬰兒神經和視覺系統發育不良風險增加之間存在關聯[24-26]。孕婦飲食中包含EPA和DHA對于確保她們的脂肪組織中含有這些必需脂肪酸，以供發育中的胎兒和母乳喂養的新生兒成長發育是非常重要的[27]。ω-3多不飽和脂肪酸對神經系統的另一個作用是預防精神疾病。盡管這些疾病的病因還不完全清楚，但目前的研究表明，食用ω-3多不飽和脂肪酸可降低抑郁的風險[25，28-29]，并改善慢性患者的抑郁癥狀[30]。患有單相抑郁癥、季節性冬季情感障礙或社交焦慮障礙患者，紅細胞膜和血漿中的EPA濃度[31]和DHA濃度[31-32]含量較低[25]。

1.6 對其他疾病的功效

其他報道的ω-3多不飽和脂肪酸的作用包括增強體重減輕對超重患者血脂血糖和胰島素水平的影響[33-34]、降低血壓[35]、減輕類風濕關節炎、神經肌肉痛、炎癥性腸病、痛經[36-37]、減少更年期婦女的潮熱[38]等。

輕度消化不良和打嗝是食用魚油的主要不良反應。汞和多氯聯苯等環境毒素可能污染魚類等海洋產品，并對人類造成潛在危害[39]。

2 含有ω-3多不飽和脂肪酸的結構脂質

結構脂質（structured lipids，SLs）是具有特殊功能或營養特性的重組甘油三酯（triacylglycerols，TAGs）。結構脂質的制備是通過化學或酶法改變甘油三酯的脂肪酸組成或脂肪酸位置分布。

sn-1和sn-3位置含有中碳鏈脂肪酸（M）和sn-2位置含有ω-3多不飽和脂肪酸（L）的結構脂質因其營養特性而備受關注。這種脂質被稱為MLM型結構脂質，綜合了不同鏈長脂肪酸的營養功能，并在體內消化代謝過程中發揮健康效應。攝入后，甘油三酯通過舌、胃，更主要是通過胰脂肪酶水解為2-單酰基甘油（2-MAG）和2個脂肪酸。對于MLM型結構脂質，消化產物是富含ω-3多不飽和脂肪酸的2-MAG和中碳鏈游離脂肪酸（medium-chain free fatty acids，MCFFA），后者具有更高的血漿清除率、更高的氧化速率、更好的氮平衡作用和更少沉積在脂肪組織中的傾向。因此，MLM型結構脂質適合為吸收不良患者、短腸綜合征患者、燒傷后的恢復患者以及早產兒快速提供能量。但是，富含中碳鏈脂肪酸的油脂往往缺乏必需的ω-3多不飽和脂肪酸。將ω-3多不飽和脂肪酸結合到甘油骨架的sn-2位置，可以更好地防止氧化[4]以及更好地以2-MAG形式被吸收[5]。MLM型結構脂質對免疫功能、氮平衡和血液中的脂質清除具有積極作用，不僅可以作為消化不良和脂質吸收不良患者的營養物質來源，而且還可以作為老年人的高附加值保健品[40]。

酶法合成結構脂質主要有三種方法：（1）富含ω-3多不飽和脂肪酸的甘油三酯與中碳鏈脂肪酸的酸解反應，其目的是用中碳鏈脂肪酸取代sn-1，3位置的脂肪酸、保留sn-2位置的ω-3多不飽和脂肪酸，反應結束后，游離脂肪酸可經蒸餾或堿提后除去。（2）分別富含ω-3多不飽和脂肪酸和中碳鏈脂肪酸的兩個甘油三酯進行酯交換反應。如果可以抑制水解反應，則產物將只有重組甘油三酯，通過去除催化劑即可回收產物。然而，產生的重組甘油三酯將包括MLM型結構脂以及其它重組甘油三酯。因此，此方法不適合制備純MLM型結構脂質。（3）兩步法，首先是甘油三酯醇解反應生成富含ω-3多不飽和脂肪酸的2-MAG，再與中碳鏈游離脂肪酸發生酯化反應制得。醇解反應后分離除去副產物，因此，該方法是合成高純度結構脂質的最適宜路線。sn-1，3特異性脂肪酶，尤其是來源于Rhizomucormiehei和Thermomyceslanuginosus的固定化脂肪酶，應用廣泛。表1總結2015—2019年該主題的研究進展，更早的研究已經在其它文獻中進行了綜述[48-49]。

表1 2015—2019年酶法制備含ω-3多不飽和脂肪酸結構脂質的國際文獻匯總

產物的產量和純度取決于所用脂肪酶的特異選擇性。例如，來源于Candida rugosa的脂肪酶由于具有脂肪酸特異性而不適合催化富含ω-3多不飽和脂肪酸油脂的酸解反應制備結構脂質[50-51]。研究表明，Candida rugosa脂肪酶不僅能特異識別甘油三酯的脂肪酸，而且可以識別整個甘油三酯分子[52-53]。Candida rugosa脂肪酶催化的水解反應分為兩步：不含DHA的甘油三酯分子首先被水解，隨著反應的進行，含有DHA的甘油三酯分子也被水解。由于甘油三酯的酸解反應是連續的水解與酯化反應，因此，Candida rugosa脂肪酶催化的富含ω-3多不飽和脂肪酸油脂的酸解反應產率較低。此外，脂肪酶的位置特異性對結構脂質的產量和純度也有影響。與不具有位置特異性的Candida antarctica脂肪酶B和Psueodomonassp.脂肪酶相比，sn-1，3位置特異性Rhizomucormiehei脂肪酶在催化月桂酸和海豹油酸解制備MLM型結構脂質中最為有效[54]。

含ω-3多不飽和脂肪酸的結構脂質的氧化穩定性是一個有待解決的主要問題[55]。近年來，富含多不飽和脂肪酸油脂體系中乳液模板化油凝膠的氧化穩定性引起了科研人員的關注。為了提高富含ω-3多不飽和脂肪酸結構脂質的氧化穩定性，進行了油凝膠微膠囊的研究。以β-谷甾醇/γ-谷維素的植物甾醇混合物或蔗糖硬脂酸酯/抗壞血酸棕櫚酸酯的混合物作為油凝膠劑，以鯡魚魚油或鯡魚魚油與辛酸和/或硬脂酸制得的結構脂質作為脂質相制備了油凝膠。結果顯示，油凝膠及其微膠囊改善了脂質的氧化穩定性[56]。之前的一項研究發現了相似的結果，即內部結構（油凝膠）和外部涂層（微膠囊）都提高了油脂氧化穩定性，原因是它們都對油脂進行了氧暴露的防護，而氧暴露是導致脂質氧化的主要因素[57]。研究表明，與液態油相比，由茶多酚棕櫚酸酯顆粒和柑橘果膠構成的茶油（富含油酸）凝膠具有更高的氧化穩定性，這可能是茶多酚棕櫚酸酯及其形成的凝膠都具有抗氧化功能的結果[58]。

3 酯交換法制備富含ω-3多不飽和脂肪酸的脂質

將ω-3多不飽和脂肪酸引入到長碳鏈脂肪酸油脂中，可以改善其營養特性。此類脂質的典型案例就是母乳脂替代品（human milk fat substitutes，HMFS）。母乳脂成分獨特，其sn-2位置主要是棕櫚酸（約占sn-2脂肪酸總量的60%）。研究表明，在母乳脂中，sn-2位置大量的棕櫚酸能提高嬰兒對脂肪和鈣的吸收，并防止鈣皂的形成。嬰兒期和幼兒期的大腦發育需要飲食中含有充足和均衡的ω-3多不飽和脂肪酸，其中，DHA對嬰兒神經系統的早期發育尤為重要。多項研究表明，血液DHA水平與認知和視覺功能的提升呈正相關，這種影響一直持續到幼兒時期[59]。嬰兒出生后，母乳是嬰兒ω-3多不飽和脂肪酸的唯一來源，其含量取決于母親的飲食。如果母親患有ω-3多不飽和脂肪酸缺乏癥和/或無法進行母乳喂養，則應通過配方奶粉補充ω-3多不飽和脂肪酸。制備母乳脂替代品最常用的方法是用三棕櫚酸甘油酯或sn-2位富含棕櫚酸的結構脂質與各種來源的游離脂肪酸進行酸解反應。除純油酸外，還使用了從不同植物油（如橄欖油、榛子油、葵花籽油、大豆油、紅花油、菜籽油、魚油或微生物油脂）中獲得的可以作為ω-3多不飽和脂肪酸（主要是DHA和AA）來源的其它游離脂肪酸[60-61]。當前的研究熱點聚焦于DHA和ARA在母乳脂替代品甘油三酯特定位點的引入，因此，篩選能夠催化制備具有特定功能結構脂質的脂肪酶的研究大幅增加[62-63]。

除了母乳脂替代品外，其他食用油也經過酶催化，引入ω-3多不飽和脂肪酸以提高其營養價值。2001—2009年期間的研究主要有三油酸甘油酯[64-65]、榛子油[66]、橄欖油[67]、大豆油[68]和棕櫚油[69-70]與ω-3多不飽和脂肪酸的酸解反應，鯡魚魚油與松脂酸[71]、雞肉脂肪游離脂肪酸[72]和共軛亞油酸[73]的酸解反應，富含DHA的2-MAG與油酸的酯化反應[74]，棕櫚仁油[75]與棕櫚油硬脂、硬脂酸乙酯（EE是乙酯的縮寫，硬脂酸乙酯縮寫應該是SAEE）[76]與富含ω-3多不飽和脂肪酸甘油三酯的酯交換反應。

4 酶法制備ω-3多不飽和脂肪酸濃縮液

濃縮液可提供更高濃度的ω-3多不飽和脂肪酸，同時減少飽和與單不飽和脂肪酸、以及總脂肪的攝入量。此外，魚類消費負面影響的主要關注點[77]為汞含量，商品魚油膠囊的汞含量從未檢出，可以忽略不記[78]。

ω-3多不飽和脂肪酸的主要濃縮方法有色譜分離、分餾或分子蒸餾、低溫結晶、超臨界流體萃取和尿素絡合法等。酶法與上述方法相比有許多優點。酶法不涉及極端pH值和溫度，從而避免因氧化、順反異構化或雙鍵遷移而部分破壞ω-3多不飽和脂肪酸的天然全順式結構。同時，溫和的反應條件也降低了工藝成本。酶法的特征之一是，由于脂肪酶的底物和位置特異性，其產物也是定向可控的。

脂肪酶催化水解、醇解和酯化反應均可用于制備ω-3多不飽和脂肪酸濃縮液。2015—2019年脂肪酶催化水解制備ω-3多不飽和脂肪酸濃縮液的國際研究情況見表2。水解反應的底物是脂質和水，方法簡單且環境友好。水解反應的產物可以簡單地通過沉降或離心進行分離。反應通常在攪拌反應釜中進行，由于是間歇工藝，無法實現在線去除副產物（游離脂肪酸），而游離脂肪酸的積累會促使水解反應速率逐漸降低。可以通過皂化或蒸餾的方式從產物中脫除游離脂肪酸。

表2 2015-2019年脂肪酶催化水解制備ω-3多不飽和脂肪酸濃縮液的國際文獻匯總

在富含ω-3多不飽和脂肪酸油脂的醇解反應中，乙醇是首選。與水解反應相比，在不含水的無溶劑環境中進行的濃縮ω-3多不飽和脂肪酸的醇解反應大大減小了設備體積，并且可以應用于填充床反應器等連續工藝。此外，與水解反應相比，基質混合得更加均勻，并且通過蒸餾更容易從油相中分離脂肪酸乙酯。近幾年的研究表明，乙醇解工藝已應用于生產富含ω-3多不飽和脂肪酸的偏甘油酯[87-88]和乙酯[89-90]。富含ω-3多不飽和脂肪酸的乙酯可作為藥物制劑使用。從營養角度來看，偏甘油酯比乙酯更適合作為乙醇解反應的最終產物，因為偏甘油酯具有更好的生物利用率[91]。此外，偏甘油酯作為“天然”產品被推廣。

在醇解反應中，可用甘油代替乙醇，以生產富含ω-3多不飽和脂肪酸的偏甘油酯。甘油解反應可以產生不同的甘油酯，且沒有脂肪酸損失，之后可以從反應混合物中提取目標脂質。近5年的研究表明，作為有前景的食品組分，具有高ω-3多不飽和脂肪酸含量的甘油二酯（Diacylglycerols，DAG）[92-93]和甘油一酯（monoacylglycerols，MAG）[93-95]可以由脂肪酶催化甘油解反應來制備。甘油酯混合物也可以通過相同的酶法制備[96]，脂肪酸形式的ω-3多不飽和脂肪酸與甘油直接酯化可用于制備富含ω-3多不飽和脂肪酸的甘油酯[97-98]。Halldorsson[99]等通過甘油選擇性酯化將EPA和DHA分離，因為EPA與甘油反應的同時DHA仍處于游離脂肪酸混合物中。

5 ω-3多不飽和脂肪酸磷脂

富含ω-3多不飽和脂肪酸磷脂（phospholipids，PL）的制備受到了關注，因為此類磷脂擁有除了多不飽和脂肪酸本身功能以外的新功能[100]。位于磷脂酰膽堿（phosphatidylcholine，PC）sn-2位置的DHA具有更強的細胞通透性、抗腫瘤活性和細胞毒性。另一方面，含有EPA的磷脂可以降低大鼠脂肪組織的重量。催化制備磷脂的酶主要有脂肪酶和磷脂酶。磷脂sn-1位脂肪酸的改性可由磷脂的酸解或酯交換反應實現。磷脂酶A1（Phospholipase A1，PLA1）催化卵磷脂與EPA、DPA和DHA混合物的酸解反應生成富含多不飽和脂肪酸的卵磷脂，其中35%的脂肪酸為多不飽和脂肪酸[101]。加水可以降低多不飽和脂肪酸的引入量，盡管結果尚未正式報道，但體系中的水預計會降低產物得率。即使不加水，水解反應也不可避免，產物中溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine，LPC）的含量為13.7%。不同作者的相似研究得到了同樣的結果[102]。當反應時間超過6 h時，酸解使多不飽和脂肪酸在磷脂酰膽堿中的含量增加，在24 h內從21%增加到28%，但水解程度的增加導致了磷脂酰膽堿產率顯著降低。考慮到磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿水平以及多不飽和脂肪酸的引入，確定了固定化磷脂酶A1催化磷脂酰膽堿酸解反應的最佳水活度為0.65[103]。除了磷脂酶A1，脂肪酶也可以用于制備富含多不飽和脂肪酸的磷脂。EPA和DHA與溶血磷脂可在脂肪酶的催化下發生區域選擇性酯化反應制備磷脂酰膽堿，產率達30%以上[104]。固定化Candida antarctica脂肪酶B是引入DHA的唯一有效酶，而EPA則可以通過固定化Candida antarctica脂肪酶B或者固定化Rhizopusarrhizus脂肪酶引入。Peng[105]等比較了脂肪酶催化酸解反應將不同脂肪酸引入大豆磷脂的結合率。共軛亞油酸和辛酸的結合率相似，但EPA和DHA的結合率相對較低。

2016年，Li等[106]通過固定化磷脂酶A1在無溶劑體系中催化磷脂酰膽堿與富含DHA/EPA的乙酯進行酯交換反應，成功合成了富含DHA/EPA的磷脂酰膽堿。在溫度55.7 ℃，加水量1.1wt%，底物質量比（乙酯/磷脂酰膽堿）6.8∶1的條件下，最大結合率為19.09%（24 h）。當加水量大于0.5wt%時，固定化磷脂酶A1的活性更高。24 h的真空處理顯著增加了DHA/EPA的結合率和富含DHA/EPA磷脂酰膽堿的含量，72 h DHA/EPA的結合率最高（30.31%），富含DHA/EPA磷脂酰膽堿的產率為47.2%[106]。2019年，Wang等[107]研究表明，固定化來源于海洋Streptomyces sp.菌株W007的脂肪酶（MAS1）可在無溶劑體系中催化富含ω-3多不飽和脂肪酸的乙酯與磷脂酰膽堿進行酯交換反應。優化實驗條件下，24 h內，ω-3多不飽和脂肪酸最大結合率為33.5%，表面固定化MAS1脂肪酶是一種具有較高催化活性的磷脂改性生物催化劑[107]。磷脂酶A2（PLA2）專一催化多不飽和脂肪酸酯化至磷脂的sn-2位。磷脂酶A2催化磷脂酰膽堿與EPA乙酯在多種有機溶劑中進行酯交換反應[108]，甲苯中EPA的結合率最高，水通過可逆水解反應形成溶血磷脂酰膽堿而影響反應的產率，含EPA磷脂酰膽堿的最高產率為14.3%。

6 結語

ω-3多不飽和脂肪酸對人體的營養價值及其對加工條件的敏感性，引起了人們對溫和加工技術如酶催化工藝的高度關注。對于魚油或任何其它油脂中ω-3多不飽和脂肪酸的富集，無論水解、酸解、醇解、酯交換還是酯化反應，所有酶促反應均可在室溫、常壓和氮氣保護下進行。因此，與傳統方法相比，脂肪酶催化魚油制備長碳鏈ω-3多不飽和脂肪酸的將更安全、高效。