一測多評法同時測定瑤藥月里瑤秘噴霧劑中7種有效成分的含量

張競之 趙丹青 王正蓉 賈金艷 楊林 張升盛 劉歆蕾 伍慶 潘衛

中圖分類號 R917;R29 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）09-1044-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.05

摘 要 目的：建立一測多評（QAMS）法同時測定瑤藥月里瑤秘噴霧劑中α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯等7種有效成分的含量，為該制劑質量控制提供方法參考。方法：采用氣相色譜法進行測定。色譜柱為DB-1701P毛細管柱，載氣為氮氣，氫火焰離子檢測器的溫度為240 ℃，程序升溫，進樣口溫度為240 ℃，進樣量為1 μL，分流比為20 ∶ 1。以檸檬烯為內參物，計算其余6種成分的相對校正因子，再根據相對校正因子計算出6種成分的含量，并與內標法（以萘為內標物）測定結果進行比較。結果：α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯檢測質量濃度的線性范圍分別為0.008 9～1.110 0、0.028 3～3.540 0、0.020 5～2.560 0、0.023 0～2.880 0、0.016 3～2.035 0、0.013 1～1.640 0、0.008 3～1.040 0 mg/mL（r均大于0.999 0）;定量限分別為0.005 6、0.013 1、0.011 4、0.018 6、0.010 8、0.008 9、0.004 5 mg/mL;檢測限分別為0.001 9、0.004 1、0.003 7、0.006 2、0.003 5、0.002 9、0.001 5 mg/mL;精密度、穩定性（24 h）、重復性試驗的RSD均小于2%（n=5或n=6）;平均回收率分別為98.48%、101.37%、97.96%、99.80%、102.79%、97.77%、102.14%，RSD均小于2%（n=9）。α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯的平均相對校正因子分別為1.045 8、0.621 0、0.488 5、0.382 9、0.708 9、0.956 9，RSD均小于2%（n=6）。QAMS法和內標法測得的7種成分的含量差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：建立的QAMS法簡便、準確、穩定且重現性良好，可用于月里瑤秘噴霧劑中7種成分的同時測定。

關鍵詞 一測多評法;瑤藥;月里瑤秘噴霧劑;氣相色譜法;質量控制

Simultaneous Determination of 7 Effective Components in Yao Medicine Yueli Yaomi Spray by QAMS

ZHANG Jingzhi1，ZHAO Danqing2，WANG Zhengrong1，2，JIA Jinyan3，YANG Lin3，ZHANG Shengsheng4，LIU Xinlei1，WU Qing4，PAN Wei1，2（1.School of Clinical Laboratory Science， Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China;2.Guizhou Provincial Prenatal Diagnosis Center， the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China;3.Guizhou Hongyu Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guiyang 550001， China;4.Guizhou Key Laboratory of Mountainous Environment Information System and Environment Protection/Analysis and Measurement Center， Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish QAMS method for simultaneous determination of 7 effective components in Yao medicine Yueli yaomi spray， such as α-cyperone， α-pinene， β-pinene， limonene， β-elemene， caryophyllene oxide and ligustilide， so as to provide method reference for the quality control of the preparation.? METHODS： GC method was adopted. The determination was performed on DB-1701P capillary column， using nitrogen as carrier gas. The temperature of the hydrogen flame ion detector was 240 ℃. The temperature was programmed， the inlet temperature was 240 ℃， the injection volume was 1 μL and the split ratio was 20 ∶ 1. Using limonene as internal reference， the relative correction factors of other 6 components were calculated， the contents of them were calculated with relative correction factors， and then compared with the results of internal standard method （using naphthalene as internal standard）. RESULTS： The mass concentration linear range of α-cyperone， α-pinene， β-pinene， limonene， β-elemene， caryophyllene oxide and ligustilide were 0.008 9-1.110 0， 0.028 3-3.540 0， 0.020 5- 2.560 0， 0.023 0-2.880 0， 0.016 3-2.035 0， 0.013 1-1.640 0， 0.008 3-1.040 0 mg/mL （all r>0.999 0）; the limits of quantification were 0.005 6， 0.013 1， 0.011 4， 0.018 6， 0.010 8， 0.008 9， 0.004 5 mg/mL; the detection limits were 0.001 9， 0.004 1， 0.003 7， 0.006 2， 0.003 5， 0.002 9， 0.001 5 mg/mL; RSDs for precision， stability （24 h）， and repeatability tests were all less than 2% （n=5 or n=6）; the average recoveries were 98.48%， 101.37%， 97.96%， 99.80%， 102.79%， 97.77%， 102.14%， and RSDs were all lower than 2% （n=9）， respectively. The average relative correction factors of α-cyperone， α-pinene， β-pinene， β-elemene， caryophyllene oxide and ligustilide were 1.045 8， 0.621 0， 0.488 5， 0.382 9， 0.708 9， 0.956 9 respectively， and the RSDs were all lower than 2% （n=6）. There was no statistical significance in contents of 7 components between QAMS method and internal standard method （P>0.05）. CONCLUSIONS： The established QAMS method is simple， accurate， stable and reproducible， and can be used for simultaneous determination for 7 components in Yueli yaomi spray.

KEYWORDS? ?QAMS; Yao medicine; Yueli yaomi spray; GC; Quality control

妊娠期糖尿病是一種妊娠期常見的并發癥，其極易增加妊娠相關母兒并發癥的風險，并且患有該病的孕婦常伴隨較嚴重的憂郁多慮、焦躁易怒等不良情緒[1-2]。同時，產后婦女多有元氣大損、氣血虧虛、瘀血的表現，臨床需要安全、溫和、毒副作用少的藥物來輔助孕產婦的機體恢復。依據瑤醫學核心“盈虧平衡理論”，產后婦女的身體虛弱、氣血不暢均為虧虛引起。瑤醫用藥原則是“虧則補之”，治療虧癥以和緩、平調臟腑的“風藥”為主[3-4]。月里瑤秘噴霧劑是由香附和當歸兩味藥經山茶油調配而成的瑤藥，其中以香附為主要藥材，當歸輔之，且兩者皆屬“風類藥”。該制劑具有較好的鎮靜安撫、補血理氣、解痙鎮痛、抗炎抑菌功效，對患有妊娠糖尿病并伴有焦慮不安情緒的孕產婦具有較好的鎮定舒緩作用，可輔助產后機體恢復。方中香附氣平，味辛，理氣解郁;當歸性溫，味甘，補血活血;兩者皆有調經止痛之功效[5]。香附的主要成分多集中在揮發油中，主要有α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、β-欖香烯、氧化石竹烯等，其中α-香附酮可調經解痛[6]，氧化石竹烯能促進細胞修復和再生，α-蒎烯、β-蒎烯和β-欖香烯有抑菌作用，并且香附中總黃酮、β-香附酮等還具有降血糖、調血脂之功效[7]。當歸的主要有效成分藁本內酯、α-蒎烯等，也存在于揮發油中[8-9]，其中藁本內酯有很強的鎮定解痙功效，對平滑肌有明顯的松弛作用[10]。

月里瑤秘噴霧劑作為以孕產婦為適用人群的瑤藥，對其進行有效質量控制必不可少。香附與當歸含有多種有效化學成分，但在缺乏某些對照品或需嚴格控制成本時，逐一對多種成分進行質量控制費時費力。有文獻報道，可采用氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC）等方法測定香附、當歸中有效成分含量[11-14]，卻未有研究能全面有效地對月里瑤秘噴霧劑中香附與當歸進行質量控制。2010年版《中國藥典》（一部）首次收錄了一測多評（QAMS）法，該法通過測定樣品中某一成分含量，建立其余各成分的相對校正因子，從而計算出各成分的含量，具有顯著降低藥物質量控制成本、高效同步測定多個成分的特點[15-16]。因此，本研究采用QAMS法，以檸檬烯為內參物，建立同時測定月里瑤秘噴霧劑中α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯等7種有效成分含量的GC法，以期為月里瑤秘噴霧劑的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7890B型GC儀、7683型自動進樣裝置、氫火焰離子化檢測器、DB-1701P型毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25? μm）均購自美國Agilent公司;XS-105型電子天平（瑞士Mettler -Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

月里瑤秘噴霧劑（批號：20190313、20190521、20190807、20191029，規格：20 mL/瓶）和缺香附的陰性樣品、缺當歸的陰性樣品、缺山茶油的陰性樣品以及缺香附、當歸、山茶油的陰性樣品（批號均為20190917，規格：20 mL/瓶）均由貴州宏宇藥業有限公司提供;α-蒎烯對照品（批號：D8-11-4，純度：≥98%）、β-蒎烯對照品（批號：127-97-3，純度：≥98%）均購于上海麥克林生化有限公司;檸檬烯對照品（北京北納創聯生物技術研究院，批號：180109，純度：≥98%）;β-欖香烯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100268-200401）;氧化石竹烯對照品（批號：A20N10L103699）、α-香附酮對照品（批號：Z08A10L94945）、藁本內酯對照品（批號：R06S10F97- 106）均購于上海源葉生物科技有限公司，純度均不低于98%;內標萘（天津市鼎盛鑫化工有限公司，批號：20161103，純度：≥99.7%）;二氯甲烷等試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 內標溶液 精密稱取適量內標萘，用二氯甲烷溶解并制備成質量濃度為1.68 mg/mL的內標溶液。

2.1.2 混合對照品溶液 分別精密稱取α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯等7種對照品適量，用二氯甲烷溶解并制成上述各成分質量濃度分別為2.22、7.08、5.12、5.76、4.07、3.28、2.08 mg/mL的單一對照品貯備液。分別精密吸取上述各貯備液83、32、425、795、205、114、215 μL以及內標溶液500 μL，置于同一5 mL量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，混勻，即得上述7種成分質量濃度分別為0.037、0.045、0.435、0.916、0.167、0.075、0.089 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液 分別精密量取月里瑤秘噴霧劑和內標溶液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加二氯甲烷定容至刻度，混勻，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液 取缺香附的陰性樣品、缺當歸的陰性樣品、缺山茶油的陰性樣品以及缺香附、當歸、山茶油的陰性樣品，分別按“2.1.3”項下方法制備成相應的陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：DB-1701P毛細管柱（30 m×0.32 mm，0.25? μm）;載氣：氮氣（純度：>99.999%）;氫火焰離子檢測器溫度：240 ℃;程序升溫（初始溫度50 ℃，保持1 min;以1 ℃/min升到65 ℃，保持2 min;再以5 ℃/min升到105 ℃，并立即以10 ℃/min升到120 ℃，再立即以 4 ℃/min升到152 ℃，保持1 min;再以8 ℃/min升到190 ℃，最后以5 ℃/min升到250 ℃）;進樣口溫度：240 ℃;進樣量：1? ? μL;分流比：20 ∶ 1。分別精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各1 μL，分別注入GC儀進行測定，記錄色譜圖。結果顯示，各成分峰均能達到基線分離，分離度均大于3，理論板數以各待測成分計均大于3 000，且陰性樣品無干擾。色譜圖詳見圖1。

2.3 線性關系考察

取“2.1.2”項下α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯單一對照品貯備液（各成分貯備液均按0.02、0.50、1.00、1.50、2.50 mL精密吸取），分別置于5 mL量瓶中，精密加入“2.1.1”項下內標溶液1 mL，用二氯甲烷定容至刻度，混勻，制成單一對照品的系列線性溶液。取上述線性溶液按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以各成分與內標質量濃度的比值為橫坐標（x）、峰面積的比值為縱坐標（y）進行回歸分析。結果顯示，α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯在各自相應的質量濃度范圍內線性關系均良好（r>0.999 0），結果詳見表1。

2.4 定量限與檢測限考察

取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，以二氯甲烷進行倍比稀釋后，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，當信噪比為10 ∶ 1、3 ∶ 1時分別測得定量限和檢測限。結果，α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯的定量限分別為0.005 6、0.013 1、0.011 4、0.018 6、0.010 8、0.008 9、0.004 5 mg/mL，檢測限分別為0.001 9、0.004 1、0.003 7、0.006 2、0.003 5、0.002 9、0.001 5 mg/mL。

2.5 精密度試驗

取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.2”色譜條件下連續進樣6次，記錄峰面積。結果，α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯峰面積與內標峰面積比值的RSD分別為0.24%、0.17%、0.31%、0.12%、0.27%、0.08%、0.14%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取“2.1.3”項下供試品溶液（批號：20190313），分別于室溫下放置0、3、6、12、24 h時按“2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果，α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯的峰面積與內標峰面積比值的RSD分別為0.75%、0.85%、0.71%、0.79%、0.64%、0.59%、0.68%（n=5），表明該供試品溶液在室溫下放置24 h穩定。

2.7 重復性試驗

取月里瑤秘噴霧劑樣品（批號：20190313），按“2.1.3”項方法平行制備6份供試品溶液，然后按“2.2”項色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按內標法計算各成分含量。結果，α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯的平均含量分別為0.023 2、0.055 0、0.169 5、0.841 4、0.133 8、0.113 8、0.077 8 mg/mL，RSD分別為0.94%、0.76%、0.87%、0.72%、0.79%、0.83%、0.69%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的同一批月里瑤秘噴霧劑樣品（批號：20190313） 0.5 mL ，共9份，分別按已知成分含量的80%、100%、120%加入相應的單一成分對照品貯備液，然后按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算各成分的回收率。結果，α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯的平均加樣回收率分別為98.48%、101.37%、97.96%、99.80%、102.79%、97.77%、102.14%，RSD分別為0.80%、1.37%、1.32%、0.67%、0.80%、0.97%、0.86%（n=9），表明該方法準確度較好，詳見表2。

2.9 相對校正因子的計算

精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，共6份，分別按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以檸檬烯為內參物，計算各化合物的校正因子：f=[Ai/ci

As/cs] 。式中，Ai為內標物峰面積，ci為內標物質量濃度，As為其他組分s的峰面積，cs為其他組分s的質量濃度。然后再計算α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯相對于檸檬烯的相對校正因子：Rf=fs/f檸檬烯。式中，fs為其他組分s的校正因子。結果顯示，α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯的平均相對校正因子分別為1.045 8、0.621 0、0.488 5、0.382 9、0.708 9、0.956 9，RSD分別為1.10%、1.23%、1.15%、1.51%、1.02%、0.75%（n=6），表明各成分相對校正因子的準確性較好。

2.10 待測組分色譜峰的定位

采用相對保留時間法進行色譜峰的定位。精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，共4份，分別按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄各色譜峰的保留時間并計算α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯相對于檸檬烯的保留時間差：ΔtRs/R檸檬烯=tRs-tR檸檬烯。式中，tRs為其他成分s的保留時間，tR檸檬烯為內標物檸檬烯的保留時間。結果顯示，以上6個成分相對于檸檬烯的保留時間差分別為29.377、5.510、3.224、18.407、25.170、30.105 min，RSD分別為0.13%、0.24%、0.17%、0.11%、0.28%、0.19%（n=4）。

2.11 樣品含量測定

取3批月里瑤秘噴霧劑樣品（批號：20190521、20190807、20191029），分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液后，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，分別采用內標法和QAMS法計算3個批次樣品中7種成分的含量。應用SPSS 19.0 統計軟件對2種方法測得結果進行t檢驗分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。結果顯示，2 種方法測定的7種成分的含量差異均無統計學意義（P>0.05），表明QAMS法用于同時測定月里瑤秘噴霧劑多種成分是可行的。7種成分的含量測定結果見表3。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

在前期研究中，筆者通過程序升溫考察了初始溫度、升溫速率以及分流比對色譜峰分離度的影響，確定了最終色譜條件為初始溫度50 ℃、分流比20 ∶ 1。此外，筆者分別考察了DB-1701P（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、DB-1701（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、HP-5（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）等4種石英毛細管柱的分離效果。結果顯示，型號為DB-1701、HP-5、DB-WAX的 3種色譜柱無法將目標峰與雜質峰分離，而型號為DB-1701P的色譜柱在分離度、峰形、響應值方面均較其他色譜柱效果更好，更適用于月里瑤秘噴霧劑的成分分析。

3.2 內標物的選擇

由于月里瑤秘噴霧的成分復雜，相比于外標法，采用內標法檢測的結果會更加準確。筆者前期分別將萘、鄰苯二甲酸二甲酯、水楊酸甲酯、丙二酸二乙酯等作為內標候選物進行了考察。結果發現水楊酸甲酯、丙二酸二乙酯、鄰苯二甲酸二甲酯的出峰時間與樣品中部分峰重合;而萘的出峰位置在檸檬烯與β-欖香烯之間，且分離效果良好，可防止系統誤差的產生。因此，在本研究中選擇萘作為內標物進行含量測定。

3.3 內參物的選擇

筆者在研究中發現，β-欖香烯和檸檬烯在月里瑤秘噴霧劑中的含量均較高且較穩定。但從質控成本角度來看，檸檬烯較β-欖香烯價格更低廉、出峰時間更快，且附近的干擾峰也較少。根據QAMS法內參物易得、價廉、有效、穩定的選擇原則[10]，本研究最終選擇檸檬烯作為內參物進行相對校正因子的計算。

綜上所述，本研究以萘為內標物，首次建立了QAMS法同時測定月里瑤秘噴霧劑中α-香附酮、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、β-欖香烯、氧化石竹烯、藁本內酯7種有效成分的含量，且和內標法測得的結果差異無統計學意義。本研究建立的QAMS法進行月里瑤秘噴霧劑的質量控制是可行的，可為該制劑的全面質量控制奠定基礎。

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（收稿日期：2020-01-02 修回日期：2020-02-29）

（編輯：林 靜）