30例胃腸道間質瘤KIT與PDGFRA基因突變檢測結果分析

黃曉青

（浙江大學醫學院附屬第二醫院 浙江 杭州 310008）

胃腸道間質瘤(Gastro intestinal stromal tumor,GIST)是消化道間葉來源腫瘤中最常見的類型，約占消化道惡性腫瘤的1～3%，腫瘤起源于Cajal間質細胞[1]。使用CD117抗體進行免疫組化檢測可以鑒定胃腸道間質瘤中CD117特征性的表達[2]。約90%的胃腸道間質瘤中KIT基因發生了功能性的突變，該突變是GIST最主要的驅動突變類型。KIT基因編碼的KIT蛋白是一種跨膜受體蛋白，受體結合干細胞因子。KIT蛋白的細胞漿內結構功能為酪氨酸激酶。因此，一旦KIT基因發生功能性突變將導致受體酪氨酸激酶的持續性激活進而引起細胞的增值能力異常升高[3]。以往研究認為胃腸道間質瘤對腫瘤化療耐藥，而且由于缺乏有效的治療手段而預后較差。甲磺酸伊馬替尼是一種針對KIT、PDGFRA以及BCR-ABL的酪氨酸激酶抑制劑靶向藥物，被批準用于治療胃腸道間質瘤。在胃腸道間質瘤中，除了KIT基因突變外，還有小部分的KIT野生型患者攜帶血小板衍生生長因子受體α（Platelet derived growth factor receptor-α，PDGFRA）基因突變，伊馬替尼同樣能結合并抑制PDGFRA[4]。

以往研究表明，KIT和PDGFRA基因突變對胃腸道間質瘤具有預后和預測的潛力，KIT基因突變往往伴隨著腫瘤的侵襲性更強臨床預后更差，而PDGFRA突變的胃腸道間質瘤生物學表型更偏向良性[5]。此外，KIT和PDGFRA基因突變對伊馬替尼藥物的療效都具有重要的預測作用[6]。近年來研究表明，免疫組化和基因突變檢測對輔助診斷胃腸道間質瘤非常有幫助，因為大約95%的腫瘤表達CD117蛋白（KIT基因編碼蛋白），而且大約90%的腫瘤攜帶KIT基因突變，大約5%攜帶PDGFRA突變。盡管CD117免疫組化陽性表達被認為是診斷胃腸道間質瘤的金標準，近年來有文獻報道存在部分間質瘤CD117、CD34、S-100或SMA表達陰性的情況，因此明確診斷往往存在困難。[7]分子研究表明，胃腸道間質瘤患者攜帶KIT基因第9外顯子突變往往表現為對伊馬替尼敏感度較弱，而攜帶KIT基因第11外顯子突變的患者對伊馬替尼敏感性較強。KIT基因外顯子13突變對伊馬替尼敏感度與外顯子11突變類似，而外顯子17突變患者往往對伊馬替尼和舒尼替尼都耐藥[8]。上述研究結果表明KIT與PDGFRA基因突變、CD117等標志物對胃腸道間質瘤患者的臨床治療具有較大臨床意義。本研究主要分析胃腸道間質瘤中KIT、PDGFRA基因突變分布及其與CD117表達、臨床病理特征之間的相關性，為GIST的靶向治療提供依據。

1.資料和方法

1.1 標本選取

本研究選取2018年—2019年存檔在浙江大學醫學院附屬第二醫院的福爾馬林固定石蠟包埋胃腸道間質瘤標本30例，每例標本由2位病理醫生重新復查確認。

1.2 免疫組化檢測

蠟塊標本進行3～5微米連續切片，切片在二甲苯中脫蠟10分鐘，重復2次，再進行梯度酒精洗脫，使用檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復，CD117抗體1：100稀釋后滴加在切片組織上，濕盒中室溫2小時，PBS清洗3次，滴加二抗（北京中杉金橋公司），濕盒中室溫30分鐘后用DAB顯色，蘇木素復染后樹膠封片。細胞膜棕色染色為陽性染色。

1.3 核酸提取

蠟塊使用切片機切取蠟卷3～5片，使用二甲苯和酒精對蠟卷進行脫蠟，用蛋白酶K對組織進行消化裂解，根據試劑盒說明書使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（Qiagen，德國）提取石蠟包埋組織中基因組DNA。

1.4 基因外顯子擴增和DNA測序

使用PCR對KIT基因外顯子9、11、13、17以及PDGFRA基因外顯子12、18進行擴增，擴增產物清潔后使用ABI3130XL測序儀進行正向與反向測序。

表1 擴增KIT與PDGFRA基因外顯子引物列表

2.結果

2.1 患者一般資料

30例胃腸道間質瘤中，男性16例，女性14例，男女比為1.14：1，平均年齡54歲（23～87歲）。

2.2 腫瘤特點

腫瘤發生部位在尾部的13例（占43.3%），腸7例（占23.3%），腸道外10例（占33.3%，包括腹腔7例、盆腔2例、腹膜1例）。

2.3 KIT基因突變分析

30例胃腸道間質瘤中，共25例檢測到了KIT基因突變，且均為CD117免疫組化表達陽性，其中23例為KIT基因外顯子11突變陽性，1例為外顯子9突變陽性，1例外顯子11與外顯子13雙突變，1例外顯子13突變陽性。在CD117陽性的患者中，KIT基因突變率為86.2%（25/29）。所有突變均為雜合性突變。在所有外顯子11的突變中，最常見的形式為缺失突變，占86.3%（19/22），單堿基突變4例，約占18.1%，最常見的突變位點為p.V559D。KIT外顯子9突變1例為插入重復突變，具體類型為p.Y503_F504insAY，與以往文獻報道一致。1例外顯子13的突變為點突變，具體類型為p.K642E，1例雙突變為外顯子11缺失突變+外顯子13點突變p.K642E（表2）。

2.4 PDGFRA基因突變分析

本研究納入的30例胃腸道間質瘤標本中（包括6例KIT基因野生型標本）未檢測到PDGFRA基因的突變，可能與GIST發病率較低，入組數量不足有關。文獻報道PDGFRA基因的突變一般存在于KIT基因野生型GIST中，以外顯子18突變為主，主要突變形式為p.D842V點突變。

2.5 KIT與PDGFRA突變與臨床病理特征的相關性

KIT、PDGFRA基因突變與胃腸道間質瘤侵襲性危險度評分無明顯相關性，與腫瘤體積、核分裂像、細胞形態、器官累及等特征也無明顯的相關性。

表2 KIT、PDGFRA、CD117檢測結果表

3.討論

近年來，靶向酪氨酸激酶治療在胃腸道間質瘤中扮演了越來越重要的角色，研究表明KIT與PDGFRA基因的突變與靶向治療的療效高度相關，KIT與PDGFRA基因的突變導致受體酪氨酸激酶的持續活化使得細胞增殖失控，因此GIST標本KIT與PDGFRA基因突變的臨床檢測變得越來越重要。

在本次研究中，我們回顧性地檢測并分析了30例GIST標本的KIT與PDGFRA基因突變情況，并比較了基因突變與CD117表達、臨床病理特征的相關性，研究結果展示了KIT與PDGFRA基因突變的突變頻率、突變類型。我們的KIT基因突變率與類型基本與以往的研究報道數據接近，但未發現PDGFRA突變，可能由于PDGFRA基因的突變頻率較低，而本研究入組的病例數太少有關。未來有必要進一步地擴大入組標本進行更詳細的研究。另外，本次入組的病人中還檢測到了1例患者同時攜帶2種驅動突變，該類患者的預后及對靶向治療的反應有待未來積累更多數據進行進一步隨訪研究。本研究數據為胃腸道間質瘤的預后及靶向治療提供一定的支持。