長順綠殼蛋雞早期發育在酶作用下性逆轉研究

李興美,何 勇,李興芳,李志惠,程德元,侯曉琪

(1.貴州農業職業學院,貴州貴陽 551400；2.貴州師范學院,貴州貴陽 550018；3.遵義市中醫院,貴州遵義 563000)

貴州長順縣綠殼蛋雞具有優良的蛋肉品質和寶貴的遺傳資源（潘周雄等，2008）。2008年長順縣綠殼雞蛋通過省無公害農產品和產地認證，2012年通過國家有機產品認證，2014年獲得農業部地理標志認證（孫鵑等，2014）。因此，長順縣綠殼蛋雞是貴州長順地區精準脫貧攻堅的重要發展產業，也是地方區域經濟發展的支柱產業。

為了提高生產力，人們已在禽性別控制方面作了一定研究。1974—1979年馬焰（譯）對來航品系雞后代雌雄性別進行研究，在未做任何處理的情況下，對不同后代雞性比的遺傳變異情況進行統計，在正常遺傳繁育中，雞的雌雄性比遺傳變異不顯著，公雞比例平均為50.9%，母雞比例平均為49.1%，雌雄遺傳性比比較平穩（馬焰，1980）。因此，不可能選出某一優勢性別作為繁育種用雞，但對雞性別的人工干預也有部分研究，如易治明和張志霞（1986）在雞性別控制研究方法中使用雌激素和雞睪丸勻漿制備的抗睪丸血清，用于人工干預孵化過程中雞胚性別，雖然最后獲得一定效果，但并不理想，雌性雞比例雖較高，但小雞孵化率極低，其效果并不顯著。張靜蓉和陳忠（2013）在雞性別決定與控制技術的研究進展中闡明，雞的性別可能是由Z 染色體和W 染色體決定，但這只是一種假說，最后具體實驗驗證和生產驗證也未見報道。雞的性別分化與生物調節劑相關，在雞胚性別分化期與芳香化酶表達高度相關，可能起活化芳香化酶轉錄作用，參與調節芳香化酶合成，對雌激素分泌進行間接調節（GOVOROUN 等，2004）。CYP19A1（cytochrome P450 19A1）編碼合成芳香化酶，進而合成雌激素，因鳥類發育受激素影響較大，故該基因是鳥類卵巢分化關鍵因子。其表達始于孵育后6.5 d，符合性腺強烈分化時期，用芳香化酶抑制劑處理性腺尚未分化的雌性雞胚（ZW），可誘導雌性向雄性的性反轉（ELBRECHT 和 SMITH，1992）。但利用芳香化酶抗體調節作用控制長順綠殼蛋雞的性別分化還未見報道，因此，本文對此進行深入研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 種蛋購于貴州省綠殼蛋雞的發源地，即貴州省長順縣鼓揚鎮聯富綠殼蛋雞養殖合作社，購買時間為2018年5月至2019年5月。

1.2 試劑及儀器 主要試劑：芳香化酶抗體50ul/瓶，稀釋液 Tris-HCl，pH=7.4，100 mL/瓶，高錳酸鉀、甲醛，均購自上海博湖生物科技有限公司。

儀器設備：雙系統全自動孵化機DZ47-63，1584 個，購自山東省德州市德城區召鵬孵化設備廠

1.3 試驗方法

1.3.1 種蛋的選擇 一般選擇生產1 周之內的新鮮蛋種蛋，清潔度、大小、蛋形、蛋殼顏色都符合種用要求。

1.3.2 孵化機的消毒 采用熏蒸消毒法，高錳酸鉀與甲醛按一定比例混合，高錳酸鉀的需要量為15 g/m3，甲醛的需要量為30 mL/m3，孵化機總空間體積為0.70 m3，高錳酸鉀為10.50 g，甲醛為21 mL，將兩者混合后放入孵化機中，然后將孵化機關閉，關好窗戶和門迅速離開。待清毒30 min后打開門、窗戶和孵化機，通風換氣2.5 d，排凈孵化機中的甲醛氣體。

1.3.3 種蛋的消毒 采用噴霧法進行種蛋消毒，配制0.1% 的新潔爾滅水溶液，取5% 新潔爾滅原液，加5 倍40℃的溫水，將配成液用噴霧器噴灑到種蛋表面5 min，晾干后送孵化機中入孵。

1.3.4 試劑的配制 芳香化酶抗體與稀釋液以1 ∶1000 的比例進行稀釋。

1.3.5 芳香化酶的作用機理 芳香化酶是一種生物調節劑，可催化睪酮最左邊的一個不規則六圓環，使最左邊的雙鍵打開，其結構變為帶有一個羥基的苯環，即睪酮轉變為雌二醇。（如圖1 所示）

1.4 試驗的過程

1.4.1 受精蛋的處理 將孵化第 4、5、6、7 天的種蛋進行照蛋，受精率約為81%，選擇發育良好的受精蛋，然后進行兩種處理。

1.4.2 胚內處理法 孵化至第4 天照蛋，選出血管發育良好的胚蛋，分別對孵化第 4、5、6、7 天的胚蛋進行處理，即在尿囊區避開大血管處打一小孔，注入已稀釋好的芳香化酶抗體稀釋液，注入劑量分別為 0.05、0.10、0.15、0.20 mL，每天每劑量注入胚蛋為80 個，最后再用蠟液化封住小孔，再返回孵化機繼續孵化。

1.4.3 胚外處理法 孵化至第4 天照蛋，選出血管發育良好的胚蛋，分別對孵化第 4、5、6、7 天的胚蛋進行處理，將預先準備好的消毒棉固定在胚蛋外面，再將已配制好芳香化酶抗體稀釋液注射到蛋外消毒棉中，以保證稀釋液能較好的浸入胚中，注入劑量分別為 0.05、0.10、0.15、0.20 mL，每天每劑量注入80 個受精蛋，最后再返回孵化機繼續孵化。

1.4.4 孵化條件 溫度為37.80℃，濕度為60%左右，最后3 d 濕度為75% 左右。

1.5 統計與分析 試驗數據采用SPSS22.0 軟件進行處理，并進行多重比較，對不同處理之間的差異性進行分析。

2 結果與分析

2.1 胚內處理結果

2.1.1 成活率的分析 由表1 可知，胚內注射芳香化酶抗體稀釋液，孵化后小雞成活率較低，平均成活率只有9.06%，死亡率高達90.94%。其中成活率最高為17.50%，最低為5.00%。通過統計分析發現，不同劑量處理之間的F=0.39，差異性不顯著（P＞0.05），表明各處理組對小雞的成活率影響不明顯；總體分析表明，不同日齡處理之間F=8.72，差異顯著（P＜ 0.05），但第 4、5、7 天之間差異性不顯著。

2.1.2 雌雄雞性比的分析 由表2 可知，通過胚內處理后，孵化成活雛雞中母雞比例較高，平均高達92.80%，公雞所占比例平均為7.20%。其中，母雞最高達到100%，最低為71.40%。通過方差分析，不同劑量處理之間的F=0.13，差異性不顯著（P＞0.05），表明不同劑量對母雞百分比效果不明顯；不同日齡處理之間的F=0.82，差異性不顯著（P＞0.05），表明不同日齡處理對母雞百分比效果不顯著。

表1 不同日齡不同劑量胚內處理對雛雞成活率的影響

表2 不同日齡不同劑量胚內處理對性別比的影響

2.2 胚外處理結果

2.2.1 成活率的分析 由表3 可知，采用胚外注射芳香化酶的抗體稀釋液，雛雞成活率較高，成活率平均為90.27%，死亡率平均為9.73%。其中，成活最高為100%，最低為80%。經分析得出：在不同劑量之間F=0.29，差異性不顯著（P＞0.05），不同劑量處理對雛雞成活率影響不顯著；總體分析不同日齡處理之間F=17.96，差異性極顯著（P＜ 0.01），但第 4、5、7 天之間差異性不顯著（P＞ 0.05）。

表3 不同日齡不同劑量胚外處理對成活率的影響

2.2.2 雌雄雞性比的分析 由表4 可知，通過蛋外處理后，最后得出雌性平均為72.82%，雄性平均為27.18%，其中最高為80.77%，最低為66.67%。通過總體分析表明，不同劑量之間處理，F=2.76，差異性不顯著（P＞ 0.05），不同劑量處理對雌性的百分比效果不明顯；不同日齡之間處理，F=25.24，差異性極顯著（P＜ 0.01）。

表4 不同日齡不同劑量胚外處理對雌雄性比的影響

3 討論

3.1 胚內處理的成活率與雌雄性比 通過采用芳香化酶抗體稀釋劑胚內注射，雛雞成活率極低，平均只有9.06%，不同日齡胚內處理與雛雞成活率之間的差異顯著（P＜0.05），不同劑量處理與成活率之間的差異性不顯著（P＞0.05），這說明注射日齡對小雞成活率有一定影響，不同劑量試劑注射對小雞成活率無顯著影響。在孵化過程中，前期發育較好，后期即出雛前4 d 左右，胚胎死亡逐漸升高。待出雛后將成活雛雞飼養至完全能辨別雌雄，雌性百分比為92.80%，雄性為7.20%。這與易治明和張志霞（1986）的研究結果相似，即將雌激素和抗睪丸雞血清制備液注入胚蛋中，68個胚蛋孵化僅成活9 只小雞，成活率為13.2%，但9 只小雞全部為雌性，雌性百分比為100%。說明胚蛋打孔注射對胚胎發育有較大影響，雛雞成活率較低。

所以，早期胚內注射芳香化酶抗體稀釋液對雞胚成活率及雌性比例的影響因素可能：一是胚蛋打孔后會受到外環境影響，打破胚內環境的平衡；二是芳香化酶抗體注入后反應太強烈，脆弱的雞胚難以適應。酶是一種量少功能強大的調節劑，所以，在孵化過程中有可能是雄性雞都被致死，而成活的只是母雞，也有可能部分是雄性雞逆轉成雌性雞。因此，胚內處理方式的代表性不強，成活母雞并不能代表是雄性逆轉獲得的。

3.2 胚外處理的成活率與雌雄性比 芳香化酶抗體稀釋劑胚外注射，雛雞成活率較高，平均為90.27%，死亡率較低，平均為9.73%。不同劑量處理對雛雞成活率差異性不顯著（P＞0.05），不同日齡胚內處理與雛雞成活率間差異極顯著（P＜0.01）。胚外處理成活雛雞養至完全能辨別雌雄，母雞比例平均為72.82%，公雞的平均為27.18%，不同劑量處理母雞的百分比差異性不顯著（P＞0.05），不同日齡之間處理母雞百分比差異性極顯著（P＜ 0.01）。

所以，雖然胚外處理母雞的比例為72.82%，與胚內處理母雞的比例為92.80% 要低些，但胚外處理的成活率較高，這可能是因為胚外處理對胚內環境沒有太大改變，胚外固定消毒棉注射芳香化酶抗體稀釋液，主要是通過外殼緩慢浸潤至胚內，對胚胎發育不可能達到致死程度。根據馬焰（譯）（1980）對來航品系雞后代雌雄性別進行研究，正常遺傳繁育中雞雌雄性比遺傳變異比例不顯著，公雞比例平均為50.9%，母雞比例平均為49.1%。本研究結果發現，母雞比例平均為72.82%，公雞比例平均為27.18%。這說明芳香化酶抗體對雞胚的發育確實起一定作用，胚外注射芳香化酶抗體稀釋液對雞性別發生了逆轉。而且胚外處理比胚內處理效果好，在孵化第6 天時胚外注射芳香化酶抗體試劑雞胚有雄性雞向雌性雞的逆轉改變。

4 結論

從試驗結果可以看出，長順綠殼蛋雞早期胚胎發育的性逆轉在芳香化酶抗體作用中起一定效果，胚外注射效果較好，但在性逆轉機制方面還不清楚。在今后研究工作中還需進一步從分子水平思考長順綠殼蛋雞性別決定的基因，性別決定的影響因素，并從性逆轉機制方面作相關探索。