江蘇韓信草HPLC指紋圖譜及其芹菜素含量測定

禹曉梅,段 瓊

(1.江蘇省徐州醫(yī)藥高等職業(yè)學(xué)校,江蘇徐州 221116；2.中國礦業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,江蘇徐州 221008)

韓信草（Scutellaria indica L.）為唇形科黃芩屬多年生草本植物，分布于我國江蘇、浙江、福建、湖南、云南等地，全草可入藥，作為我國地方傳統(tǒng)藥材一直被廣泛使用。其性味辛、苦、寒，具有止血消腫、清熱解毒、活血止痛等作用，可用于治療跌打損傷、肝熱煩躁、肺熱喘咳、毒蛇咬傷等（林建化和陳劍，2012 ；黃蘅和陳學(xué)松，2010 ；南京中醫(yī)藥大學(xué)，2006）。現(xiàn)代研究證明，韓信草中主要活性成分為黃酮類化合物，具有抗病毒、抗腫瘤的作用，具有很大的臨床應(yīng)用價值（商國懋和鄧玉娟，2015 ；潘偉東等，2015）。民間亦常用韓信草為畜類活血行瘀、消炎鎮(zhèn)痛。有關(guān)專家認(rèn)為，由于中藥既可預(yù)防和治療疾病，促進(jìn)動物生長，又不會產(chǎn)生危害人體健康的藥物殘留，我國傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥已逐步受到廣大獸藥生產(chǎn)企業(yè)和畜禽養(yǎng)殖者的重視，將在很大程度上逐步取代化學(xué)藥品（葛偉三和趙國敏，2018）。但目前韓信草并未收錄載入《中國藥典》，對其質(zhì)量控制沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，關(guān)于韓信草的相關(guān)文獻(xiàn)報道較少，多是性狀鑒別、化學(xué)成分分離鑒別、含量測定等，質(zhì)量控制比較薄弱（趙野等，2018 ；王領(lǐng)弟等，2017 ；梁現(xiàn)蕊和趙萃，2016 ；王玉寶，2014）。

據(jù)報道，不同產(chǎn)地中藥材化學(xué)成分組成及含量存在一定差異，中藥指紋圖譜能全面反映中藥材的整體性化學(xué)表征，對中藥材的質(zhì)量控制具有整體性、全面性（劉盼等，2019 ；張依欣等，2019 ；魯惠玲等，2018 ；譚 鵬 等，2018 ；任波等，2018 ；張 利 等，2017 ；Xu 等，2017 ；Li 等，2016 ；吳娜等，2016 ；劉興勇等，2015）。為保證韓信草藥材臨床用藥質(zhì)量，本文采用HPLC 法對江蘇不同產(chǎn)地的10 批韓信草藥材進(jìn)行研究，建立了韓信草中藥指紋圖譜，同時測定了藥材中芹菜素的含量，以期尋找江蘇不同產(chǎn)地間韓信草藥材的異同，為江蘇乃至全國唇形科植物韓信草的質(zhì)量控制及進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀，美國安捷倫科技（中國）有限公司；電子天平（EL104），梅特勒- 托利多儀器有限公司；中藥粉碎機(jī)（JP-500C），浙江永康久品工貿(mào)有限公司；超聲清洗器（AS7240A），天津奧特賽恩斯儀器有限公司；Mili-Q 純水系統(tǒng)，美國Milipore 公司；移液槍（Research plus），德國艾本德公司。

1.1.2 主要試劑 芹菜素（批號YS202012），安徽合肥博美生物，純度＞98% ；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、冰醋酸（分析純），均購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；10 批韓信草藥材來源見表1，由江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院徐州醫(yī)藥分院程詠梅教授鑒定為韓信草干燥全草。

表1 10 批韓信草全草藥材編號及來源

1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDBC18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相 ：0.5%冰醋酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，梯度程序見表2；檢測波長：275 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫 ：35℃ ；進(jìn)樣量 ：10 μL。

表2 梯度洗脫程序表

1.3 溶液配制

1.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取芹菜素對照品適量，置于50 mL 容量瓶中，加乙腈溶液定容，搖勻，得芹菜素對照品儲備液（0.7 mg/mL）。

1.3.2 供試品溶液的制備 取各批次干燥韓信草藥材全草，粉碎，過80 目。精密稱取過篩后的韓信草樣品0.5 g 置于具塞錐形瓶中，依次加入60、30 mL 70% 的甲醇溶液，分別超聲輔助提取45 min，放冷過濾，合并濾液，水浴蒸至微干，殘渣轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶，用乙腈定容，再用0.45 μm微孔過濾膜過濾，即得。

2 方法與結(jié)果

2.1 江蘇不同產(chǎn)地韓信草HPLC 指紋圖譜的建立

2.1.1 精密度實驗 取同一批次韓信草（S05），按照“2.3”項下實驗方法制備供試品溶液1 份，按“2.1”項下方法設(shè)置儀器色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5 次，得到相應(yīng)色譜圖。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間的相對偏差（RSD）在0.10% ～0.28%，共有峰峰面積的相對偏差（RSD）在1.2% ～2.9%，均小于3.0%，表明在該色譜條件下儀器精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性實驗 取同一批次韓信草（S05），按照“2.3”項下實驗方法平行制備供試品溶液5份，按照“2.1”項下方法設(shè)置儀器色譜條件，分別進(jìn)樣，得到相應(yīng)色譜圖。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間的相對偏差（RSD）在0.14% ～0.35%之間，共有峰峰面積的相對偏差（RSD）在0.50% ～2.1%，均小于3.0%，表明在該實驗驗條件下，方法重復(fù)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性實驗 取同一批次韓信草（S05），按照“2.3”項下方法制備供試品溶液1 份，按照“2.1”項下方法設(shè)置色譜儀器，將供試品溶液放置0、2、4、8、12、24、48 h 后分別進(jìn)樣，得到相應(yīng)色譜圖。結(jié)果表明，各共有峰的相對保留時間的相對偏差（RSD）在0.21% ～0.48%，共有峰峰面積的相對偏差（RSD）在0.23% ～2.5%，均小于3.0%，表明在該實驗條件下供試品溶液48 h 穩(wěn)定。

2.1.4 韓信草指紋圖譜的建立及評價 將10 批韓信草藥材按照“2.3”項下實驗方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件設(shè)置儀器色參數(shù)分別進(jìn)樣，得到相應(yīng)色譜圖。將10 批不同產(chǎn)地的韓信草色譜圖積分處理后，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件對譜圖進(jìn)行分析，采用中位數(shù)法生成韓信草的HPLC 指紋圖譜及對照指紋圖譜，分別見圖1、圖2。根據(jù)10 批韓信草藥材的指紋圖譜檢測結(jié)果確定15 個共有峰，通過對照品比對（見圖3），指認(rèn)13 號峰為芹菜素。

2.1.5 指紋譜圖相似度評價 將10 批韓信草藥材色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度評價計算，得到其指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.970、0.932、0.968、0.917、0.981、0.956、0.964、0.958、0.929、0.973，相似度均在0.910 以上，表明江蘇省內(nèi)不同產(chǎn)地的韓信草藥材各批次之間化學(xué)成分及其含量差異不大。

2.2 江蘇不同產(chǎn)地韓信草中芹菜素含量的測定

2.2.1 精密度實驗 精密吸取同一韓信草供試品溶液（S05），按照“2.1”項下色譜方法設(shè)置儀器參數(shù)連續(xù)進(jìn)樣5 次，得到相應(yīng)色譜圖，計算芹菜素峰面積含量的RSD 為1.42%，表明在該色譜條件下，儀器精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性實驗 取同一批次韓信草（S05），按照“2.3”項下實驗方法平行制備供試品溶液5份，按照“2.1”項下方法設(shè)置儀器色譜條件分別進(jìn)樣，得到相應(yīng)色譜圖。計算芹菜素峰面積含量的RSD 為0.98%，表明在該實驗條件下方法重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性實驗 取同一批次韓信草（S05），按照“2.3”項下方法制備供試品溶液1 份，按照“2.1”項下方法設(shè)置色譜儀器，將供試品溶液放置 0、2、4、8、12、24、48 h 后分別進(jìn)樣，得到相應(yīng)色譜圖。計算芹菜素峰面積含量的RSD 為1.2%，表明在該實驗條件下，供試品溶液中芹菜素含量48 h 穩(wěn)定。

2.2.4 加標(biāo)回收率實驗 精密稱取韓信草樣品S05（含芹菜素 1.45 mg/g）適量，按照“2.3”項下實驗方法平行制備供試品溶液9 份，并將供試品溶液分為3 組，每組分別用移液槍精密加入0.50、1.00、1.20 mL 芹菜素儲備液，用乙腈定容至25 mL 容量瓶，搖勻，作為供試品溶液。按照“2.1”項下方法設(shè)置儀器色譜條件進(jìn)樣，計算加標(biāo)回收率及RSD，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，該方法具有良好的回收率。

表3 韓信草中芹菜素加標(biāo)回收率實驗

2.2.5 線性關(guān)系與檢測限 分別精密移取“2.2”項下芹菜素對照 品溶液 1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL 至 50 mL 容量瓶中，制成每 1 mL分 別 含 芹 菜 素 對 照 14.00、28.00、56.00、84.00、112.0、140.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照“2.1”項下色譜條件設(shè)置儀器參數(shù)分別進(jìn)樣，記錄各色譜峰峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得芹菜素線性回歸方程：A=8.645C+10.472（r=0.9997）。結(jié)果表明，黃芩苷濃度為7.00 ～70.00 μg/mL 時，濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系。逐級稀釋降低對照溶液濃度進(jìn)行測定，直至信噪比為3 ∶1 得溶液檢測限為0.2013 μg/mL。

2.2.6 含量測定結(jié)果 取10 批韓信草藥材，按照“2.3”項下方法制備韓信草供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件設(shè)置儀器參數(shù)分別進(jìn)樣，計算各批藥材中芹菜素含量，結(jié)果見表4。

表4 10 批韓信草藥材中芹菜素含量 mg/g

3 討論

3.1 供試品的制備 本研究比較了不同濃度的甲醇、乙醇提取效果，結(jié)果顯示，用70% 的甲醇提取更能全面顯示韓信草的化學(xué)成分，且分離度好；比較了回流提取、索氏提取和超聲提取的提取效果，結(jié)果顯示，得到的供試品色譜圖無明顯差異，因超聲提取較為方便，故選擇超聲提取；實驗同時對超聲提取次數(shù)及超聲時間進(jìn)行了考察，最終確定以60 、30 mL 70% 甲醇分別提取45 min，合并濾液作為供試品效果最佳。

3.2 HPLC 色譜條件的優(yōu)化 本研究分別考察了水- 乙腈、水- 甲醇、冰醋酸水溶液- 乙腈、冰醋酸水溶液- 乙醇等流動相體系，經(jīng)反復(fù)優(yōu)化比較，以0.5%冰醋酸水溶液-乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫，分離效果最佳。以芹菜素進(jìn)樣，采用二極管陣列全波長掃面，選擇275、280 nm 兩個檢測波長，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)275 nm 波長下韓信草供試品分離度及峰形更好，基線更平穩(wěn)，故選擇275 nm 作為檢測波長。

4 結(jié)論

本研究建立了江蘇不同產(chǎn)地韓信草指紋圖譜，確立了15 個共有峰，相似度均在0.91 以上，同時對江蘇不同產(chǎn)地的韓信草有效成分芹菜素進(jìn)行含量測定，結(jié)果表明，10 批韓信草藥材中芹菜素的含量均在1.25 ～1.48 mg/g 之間，含量變化幅度不大，說明江蘇各產(chǎn)地的韓信草質(zhì)量較為穩(wěn)定。所建立的方法靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為韓信草藥材質(zhì)量控制的重要參考依據(jù)，為建立科學(xué)的中藥、中獸藥質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ)。