miR-375、miR-146a及miR-21在慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化及肝癌患者中表達(dá)及其對肝癌的診斷意義

昝麗娜 孫峰 張永娟 張靜

(亳州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心，安徽 亳州 236800)

慢性乙型病毒性肝炎(簡稱乙肝)是臨床常見的一種可通過血液、體液接觸而傳播的疾病〔1〕。肝硬化是一種肝損害疾病，臨床表現(xiàn)為壓痛、肝功能減退、黃疸、腹脹、黑便及腹水等，其病程緩慢并伴有各種并發(fā)癥，如消化道出血、肝性腦病及肝腎綜合征等，當(dāng)進(jìn)入失代償階段時易發(fā)生癌變，從而進(jìn)展為肝癌〔2,3〕。肝癌在人類惡性腫瘤中可排前3位，是肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞發(fā)生惡性病變所致。肝癌的發(fā)病率及死亡率均較高，嚴(yán)重威脅人類的生命健康〔4〕。肝癌的發(fā)病與乙肝、肝硬化均有著密切關(guān)系，肝癌的高發(fā)生率一部分原因是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致〔5〕。由于缺乏早期有效的診斷，大部分肝癌患者一旦發(fā)現(xiàn)就處于中晚期，錯過最佳手術(shù)時機(jī)，導(dǎo)致患者預(yù)后較差〔6〕。因此尋找靈敏度高、特異度好的肝癌標(biāo)志物是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。HBV-DNA、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)和堿性磷酸酶(ALP)是常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室檢測項(xiàng)目，而miRNA是一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)關(guān)鍵的因子，研究證實(shí)，其在肝癌的發(fā)生及發(fā)展中起到十分重要的作用〔7〕。miRNA在血漿中可穩(wěn)定存在，可通過檢測患者血清的方式對其表達(dá)情況進(jìn)行觀察。本研究通過對慢性乙肝患者、肝硬化患者及肝癌患者實(shí)驗(yàn)室常規(guī)項(xiàng)目及血清中miRNA(miR)-375、miR-146a及miR-21表達(dá)進(jìn)行檢測，以期為肝癌的早期診斷提供依據(jù)和新的研究方向。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月至2018年2月毫州市人民醫(yī)院收治的43例慢性乙肝患者納入慢性乙肝組，36例肝硬化患者納入肝硬化組，31例肝癌患者納入肝癌組，慢性乙肝患組男29例，女14例，平均年齡(58.85±7.89)歲；肝硬化組男25例，女11例，平均年齡(59.13±7.65)歲；肝癌男21例，女10例，平均年齡(63.22±7.93)歲；3組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合慢性乙型肝炎、肝硬化及肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔8～10〕；②病例資料完整；③簽署知情同意書；排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有精神類疾病；②合并心腦腎等重要器官障礙者；③其他惡性腫瘤患者。

1.2方法

1.2.1相關(guān)儀器及試劑 實(shí)驗(yàn)主要儀器為：全自動生化分析儀(美國貝克曼)、實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增儀(上海宏石)、離心機(jī)(上海強(qiáng)生醫(yī)療器材有限公司)、S100型PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)、水浴鍋(常州諾基儀器有限公司)、垂直電泳儀(美國Bio-Rad公司)、Tanon 1600凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；主要試劑：裂解液(德國Qiagen公司)、Trizol試劑(美國Invitrogen公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)、Taqman microRNA 探針(美國Applied Biosystems公司)。

1.2.2樣本采集 采集3組外周靜脈血(禁食8 h)5 ml，20℃下靜置30 min，離心機(jī)2 500 r/min離心10 min，取上清，5 000 r/min離心10 min，檢測HBV-DNA、ALT、AST、GGT和ALP，其余血清置入-80℃冰箱備存，用于miR-375、miR-146a及miR-21的批量檢測。

1.2.3miR-375、miR-146a及miR-21檢測 采用qRT-PCR技術(shù)檢測miR-375、miR-146a及miR-21的表達(dá)：①取出樣本并進(jìn)行解凍；②按照Trizol試劑的說明書提取組織總RNA(純度比值范圍控制：1.8～2.0)；③標(biāo)記microRNA，并進(jìn)行miRNA芯片雜交，并掃描及數(shù)據(jù)分析；④選取miRNA芯片結(jié)果中的miR-375、miR-146a及miR-21進(jìn)行熒光定PCR分析：采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒配置反應(yīng)混合物，反轉(zhuǎn)錄合成環(huán)狀DNA；RT-PCR反應(yīng)條件：95℃變性10 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s，40個循環(huán)，相關(guān)引物序列由上海生工公司提供，每個樣品目的基因的CT值用內(nèi)參基因(U6RNA)來進(jìn)行歸一化，獲得實(shí)驗(yàn)樣品和對照樣品的△CT值，目的基因相對U6的表達(dá)量=2-△CT，最后計(jì)算miR-375、miR-146a及miR-21相對表達(dá)量2-△△CT。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、受試者工作特征(ROC)曲線分析。

2 結(jié) 果

2.13組血清HBV-DNA陽性率比較 肝硬化組血清HBV-DNA陽性率〔23例(63.89%)〕明顯低于慢性乙肝組〔39例(90.70%)〕和肝癌組〔28例(90.32%)〕，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.57，P<0.05)；慢性乙肝組血清HBV-DNA陽性率與肝癌組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.23組血清ALT、AST、GGT和ALP水平比較 3組血清ALT、AST、GGT和ALP水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，肝癌組血清ALT、AST水平明顯低于慢性乙肝患者，血清ALP水平明顯高于慢性乙肝組(P<0.05)；肝癌組血清GGT水平明顯高于慢性乙肝組和肝硬化組(P<0.05)。見表1。

表1 3組血清ALT、AST、GGT和ALP水平比較

2.33組血清miR-375、miR-146a及miR-21表達(dá)情況 miR-146a及miR-21在慢性乙肝組、肝硬化組及肝癌組血清中的水平呈現(xiàn)顯著增高趨勢，miR-375表達(dá)則呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢(P<0.05)，見表2。

表2 3組miR-375、miR-146a及miR-21表達(dá)情況

2.4miR-375、miR-146a及miR-21對肝癌診斷情況 miR-375、miR-146a及miR-21三者聯(lián)合對肝癌的診斷效能明顯優(yōu)于使用單一指標(biāo)(P<0.05)，見表3，圖1。

表3 miR-375、miR-146a及miR-21對肝癌診斷情況分析

圖1 miR-375、miR-146a及miR-21對肝癌的診斷價值

3 討 論

全球范圍內(nèi)有超過3.5億的慢性乙肝患者，每年約60萬慢性乙肝患者發(fā)生死亡，慢性乙肝是導(dǎo)致肝硬化及肝癌的重要原因〔11〕。慢性乙肝的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前仍不能完全闡述清晰，其可能與凋亡相同基因、自身免疫及肝炎病毒等多種因素作用有關(guān)〔12〕。慢性乙肝具有經(jīng)久不愈及反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，隨著病情的發(fā)展，大量肝細(xì)胞凋亡，肝功能障礙嚴(yán)重，易導(dǎo)致肝纖維化，進(jìn)行形成肝硬化〔13〕。通常肝硬化的起病較隱匿，病程較長，可持續(xù)3～10年〔14〕。當(dāng)慢性乙肝患者的肝細(xì)胞發(fā)生彌漫性壞死、肝臟出現(xiàn)纖維性增生，則基本上可判斷進(jìn)入早期肝硬化，隨著肝硬化的病程進(jìn)展，若不及時治療，患者肝功能損害加重、膠原會明顯增多，并于竇狀間隙內(nèi)各處過度沉積，并演變成毛細(xì)血管，發(fā)生大量物質(zhì)交換，發(fā)生纖維化及結(jié)節(jié)狀再生，極易發(fā)生癌變〔15〕。

血清HBV-DNA、ALT、AST、GGT和ALP的水平是常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測項(xiàng)目，多年來用于慢性乙肝、肝硬化和肝癌患者的臨床診斷和治療。本研究結(jié)果說明對于HBV-DNA水平一直較高的乙肝患者，在其明顯下降的時候，一定要提防病程的進(jìn)展，而肝硬化患者如果出現(xiàn)血清HBV-DNA水平的突然增高，要及時排除肝癌的可能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALT、AST、ALP、GGT等酶的改變對于判斷慢性乙肝患者的疾病進(jìn)程均有一定的輔助作用。焦嬌等〔16〕指出，HBV-DNA水平及血清酶的改變是慢性乙肝和肝硬化患者發(fā)展為肝癌的危險因素。

miRNA屬于一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)關(guān)鍵的因子，可調(diào)節(jié)多個，乃至數(shù)百個靶基因，參與自身免疫疾病發(fā)生及發(fā)展過程，在機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)育、免疫應(yīng)答及自身免疫中起重要作用〔17〕。miRNA不僅會參與人體細(xì)胞生長和分化的生理過程，還可參與炎癥及癌變等病理過程。研究證實(shí)，miRNA參與了肝細(xì)胞生長、病毒感染、應(yīng)激反應(yīng)及肝表型的維持等，可反映肝細(xì)胞及組織水平的基礎(chǔ)生理狀態(tài)，在肝癌的發(fā)生及發(fā)展中起到重要作用〔18〕。miR-146a會對炎性反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用，可監(jiān)測自身免疫性疾病病情的活動性〔19〕。miR-375最早是在胰島β細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，其可調(diào)控胰島素的形成及分泌，大量研究發(fā)現(xiàn)，miR375在腫瘤組織中會呈現(xiàn)低表達(dá)〔20〕。miR-21是一種研究最早也是較特殊的miRNA，在細(xì)胞增殖、分化及凋亡過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示，在消化系統(tǒng)腫瘤(胰腺癌、胃癌及肝癌等)中miR-21表達(dá)均上調(diào)〔21〕。本研究結(jié)果究其原因?yàn)閙iR-146a可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量炎癥因子，加重患者的炎癥反應(yīng)，使患者的肝臟受累程度加重。miR-21會誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)肝硬化發(fā)生，并可作為一種原癌基因，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的分化及生長，并增強(qiáng)其侵襲與轉(zhuǎn)移，從而在肝癌患者體內(nèi)的表達(dá)呈異常上調(diào)。

目前對肝癌的診斷主要通過影像學(xué)及病理檢測，但難免存在較高的漏診，尤其對早期肝癌的診斷率并不高。miRNA可通過形成脂蛋白復(fù)合物的形式抵抗RNA酶降解，可在血液中相對穩(wěn)定存在，可通過反復(fù)提純而檢測到，減少入侵性的檢查，其檢測快捷、簡單而有效，適合臨床上對肝癌的早期篩查。本研究結(jié)果說明聯(lián)合檢測血清miR-375、miR-146a及miR-21表達(dá)情況，可作為肝癌，尤其對于乙肝肝硬化背景的肝癌的理想診斷標(biāo)志物。