血漿HoxD10啟動子甲基化監測胃癌的價值

陳麗莉 吳素娜 楊曉敏 陸振斌 劉樂偉 徐煥海

胃癌（GC）是最常見的惡性腫瘤之一，病死率占居我國腫瘤死因的第二位［1］。由于GC的預后與疾病的診斷階段密切相關，因此迫切需要針對早期階段的新診斷方法和新療法。GC的發生發展與癌基因的激活和抑癌基因的失活直接相關；表觀遺傳學改變常發生在人類GC中，基因啟動子區域甲基化過高，基因組整體甲基化過低，組蛋白修飾和非編碼RNA改變是GC的主要表觀遺傳學變化［2］。Homeobox D10（HoxD 10）是同源盒超家族基因之一，在胚胎細胞的分化和GC的進展中起關鍵作用［3］。Hox D10是一個候選GC抑癌基因，其CpG島發生異常甲基化，故明確其細胞信號轉導、細胞周期和凋亡等多個方面的表達調控機制，有助于加深認識對GC進展等機制［4］。因此，本文探討血漿中HoxD 10啟動子甲基化對GC表達調控作用，分析其在GC組織的關系。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月至2015年6月本院收治的門診及住院患者，簽署知情同意書。以胃鏡病理診斷為診斷標準，腸上皮化生（IM）組、不典型增生（IN）組、GC組各30例。另收集健康志愿者樣本為正常對照組（NC）10例。排除其他胃腸疾病，排除合并其他系統腫瘤或胃轉移瘤情況，單純胃癌患者排除已經接受外科手術或術前化學療法或放射療法者，而術后復發者為經內鏡下或外科病灶切除治療，除外放化療。收集研究對象的全血5ml，并通過以2500r/min離心血液15min分離血漿，并轉移至1.5ml EP管中，置于-80℃冰箱保存。然后，根據組織病理學診斷將樣品分組。如在一種情況下發生多種病理變化，則診斷應以更高級別的病變為準。根據美國癌癥聯合委員會（AJCC）分期手冊對GC的腫瘤分期進行分類［5］。

1.2 方法 （1）血漿標本收集及處理：全血5ml經離心獲取上層血漿并轉移至1.5ml EP管中，置于-80℃冰箱保存。集中送本院消化細胞和分子生物實驗室進行檢測血漿樣本HoxD10的甲基化狀態。（2）血漿游離DNA的提取：用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取血漿中游離的DNA，檢測提取DNA的純度和濃度。盡量保證純化的DNA OD260/OD280在1.6～1.8。提取DNA于-20℃下保存備用。（3）血漿游離DNA的修飾與純化：根據QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen，Hilden，Germany）的說明從血漿樣品（400μl）中提取DNA。將提取的DNA溶解在50μl洗脫緩沖液中，并保存在-20℃以下。用EZ DNA MethylationGold? Kit試劑盒（美國加利福尼亞州奧蘭治的Zymo Research）對上述提取的DNA進行重亞硫酸鹽處理，未甲基化的胞嘧啶（C）轉化為尿嘧啶（U），并且通過柱層析一步完成DNA的純化和脫硫，回收的DNA可用于甲基化特異性PCR反應。純化的DNA重懸于10μl洗脫緩沖液中，于-20℃冰箱保存，于2d內進行PCR操作。（4）甲基化特異性PCR［5］：甲基化和非甲基化特異PCR引物，進行甲基化特異性PCR（methylation-Specific PCR，MSP，簡稱M）。用M進行PCR時，甲基化的DNA能產生特異PCR條帶，而未甲基化的DNA則不能產生MSP條帶（PCR，UMSP，簡稱U）。用U擴增時，未甲基化的DNA能產生特異性PCR條帶，甲基化的DNA不能產生PCR條帶。啟動子區發生部分甲基化時，甲基化和非甲基化特異引物都將出現PCR擴增，由此可評估血漿游離DNA中HoxD10啟動子區的甲基化水平。配置與設置MSP反應體系與反應程序，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Gelred染色，觀察產物條帶。

1.3 評定指標 （1）評估外周血HoxD10啟動子甲基化情況，根據PCR擴增的條帶來判斷HoxD10的甲基化水平。甲基化結果判斷：完全甲基化陽性：M有特異產物，U無產物；部分甲基化陽性：M、U均有特異產物；甲基化陰性：U有特異產物，M無產物。其中甲基化陽性：完全與部分甲基化陽性。（2）評估血清胚抗原（CEA），糖類抗原（CA19-9）和幽門螺桿菌感染狀態與通過酶聯免疫吸附測定法評估血清CEA和CA19-9水平。CEA和CA19-9分別被認為是陽性標準 ：CEA ≥ 5ng/ml和 CA19-9 ≥ 40U/ml［6］。當快速尿素酶實驗（RUT）和13C尿素呼氣試驗（UBT）或組織學分析均呈陽性結果時，診斷為幽門螺桿菌感染。（3）記錄性別、年齡、Karnofsky功能狀態評分標準（KPS評分）、腫瘤直徑、幽門螺桿菌感染、病理分期分型和胃癌預后等詳細臨床資料，統計分析HoxD10甲基化水平與胃癌前期病變以及胃癌分型，患者預后等相關性。

1.4 隨訪 患者隨訪時間40個月，末次隨訪時間截至2019年12月。記錄患者手術之日起至腫瘤復發、轉移或死亡時間。其中總生存期（OS），即手術之日起至患者死亡為止，以末次隨訪時間計算。

1.5 統計學方法 采用SPSS 16.0統計學軟件。計數資料以n（%）表示，用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組患者的臨床資料比較 見表1。

表1 各組患者的臨床資料比較（）

表1 各組患者的臨床資料比較（）

組別 n 性別（男/女） 年齡（歲） Hp（+/-/缺少）NC組 10 6/4 62.11±5.26 6/4/0 IM組 30 18/12 63.36±4.85 8/22/0 IN組 30 20/10 61.74±5.23 5/25/0 GC組 30 21/9 63.25±5.77 5/10/15

2.2 各組患者血漿中檢測HoxD10啟動子甲基化的瓊脂糖凝膠電泳結果比較 不同組患者血漿中檢測HoxD10甲基化與非甲基化特異性引物的瓊脂糖凝膠電泳結果。見圖1。

圖1 血漿HoxD10啟動子中MSP反應測定的代表性瓊脂糖凝膠電泳結果

2.3 各組患者血漿中檢測HoxD10啟動子甲基化頻率比較 在NC→IM→IN→GC發生過程中，HoxD10啟動子甲基化頻率均明顯增加（P<0.01）。NC組血漿DNA中無HoxD10基因被甲基化，表明每個單獨的生物標記物對于區分GC和癌前病變與NC的特異性均為100%。見圖2。

圖2 不同組患者血漿中檢測HoxD10啟動子甲基化頻率

2.3 HoxD10啟動子甲基化狀態與GC患者臨床病理特征的相關性 HoxD10啟動子甲基化狀態與GC患者性別、年齡、KPS評分無相關（P>0.05）。腫瘤直徑>5cm與病理分級為高級別（III～IV級）患者HoxD10啟動子甲基化陽性率均明顯較高（P<0.05）；幽門螺桿菌感染、血清CA19-9與血清CEA陽性患者的HoxD10啟動子甲基化水平明顯更高（P<0.05）。見表2。

表2 HoxD10啟動子甲基化狀態與GC患者臨床病理特征關系

2.5 GC及其不同病理分級患者HoxD10啟動子甲基化的Kaplan-Meier生存分析比較 Kaplan-Meier生存曲線表明，HoxD9啟動子甲基化陽性GC患者比HoxD9啟動子甲基化陰性GC患者的40個月生存率明顯降低（P<0.05）。在高級別（III～IV級）GC患者中，HoxD9啟動子甲基化陽性者的生存率明顯更低（P<0.01）。在低級別（I～II級）GC患者中，HoxD9啟動子甲基化陽性者的生存率也明顯降低（P<0.05）。見圖3。

3 討論

目前GC單純通過病理組織形態學早期診斷胃癌較為困難，導致早期診斷率較低、檢出率低［7］。慢性胃炎，萎縮，腸上皮化生（IM）和上皮內瘤變（IN）最終發展為GC，而胃IM和IN是癌前病變，會觸發至少10倍的發展GC風險［8］。常規血清學腫瘤生物標記物，如碳水化合物抗原19-9（CA19-9）和癌胚抗原（CEA），可能會幫助但缺乏特異性，且對于早期或伴癌前病變的GC識別不敏感，較難將其作為胃癌診斷的硬性指標［9］。目前，胃鏡檢查和活檢仍是確認GC的最有效方法。然而，侵入性檢查過程，引起受試者不適。通常，患者不愿進行胃鏡檢查，這導致治療延遲。因此，迫切需要尋求一種簡便、無創、有效且特異性高的檢測方法對GC的早期診斷、治療和預后隨訪有著極其重要的意義。

遺傳和表觀遺傳學改變均有助于胃癌的發生。通過異常DNA甲基化使腫瘤抑制基因（TSG）轉錄沉默被認為是各種癌癥起源中的關鍵表觀遺傳事件［10-11］。研究表明，在癌癥診斷之前可以檢測到體液中的甲基化DNA［12-13］。基于患者體液中循環的無細胞DNA（cfDNA）技術代表GC篩選有希望替代的方法。前期研究篩選的可能與胃癌相關的新的候選基因HoxD10基因，在胚胎發育過程中細胞分化和形態發育控制起重要作用［3-4］。近年來研究發現，Hox家族基因與多種惡性腫瘤的發生、發展及預后密切相關，在GC中以及表觀癌前病變中被表觀沉默［14］。同時，在來自GC和IN患者的血液樣本中檢測到HoxD10的異常DNA甲基化，表明其潛在以無創方式早期檢測GC和癌前病變［15］。但單個基因甲基化的敏感性仍然不令人滿意，對多個基因的聯合檢測可能是一個不錯的解決方案。現發現血漿中存在HoxD10甲基化與更深的腫瘤浸潤有關，這與以前的發現一致，即HoxD10的異位表達損害GC細胞的侵襲，且在GC組織中檢測到HoxD10啟動子過度甲基化與TNM分期有關，并表明預后不良［16］。同樣，HoxD10可能是晚期的標志物，在晚期GC中顯示出高水平的甲基化，而在早期GC中顯示出低得多的水平［17］。本研究結果顯示，對于HoxD10基因，從NC→IM→IN→GC的發生過程中，HoxD10啟動子甲基化頻率均明顯增加（P<0.01）。對于NC組，血漿DNA中無HoxD10基因被甲基化，即表明每個單獨的生物標記物對于區分GC和癌前病變與NC的特異性均為100%。

圖3 Kaplan-Meier生存分析

大量研究顯示，約90%的DNA片段在腫瘤患者中發生不同程度的甲基化改變，且較多研究提示在GC前病變患者外周血中也存在甲基化現象［18-19］。通過檢測從NC→IM→IN→GC等不同時期患者血漿中HoxD10啟動子區的甲基化頻度變化，并結合患者臨床與病理數據，有助于分析血漿HoxD10啟動子甲基化水平與GC進展是否存在關聯［20］。進一步研究顯示，HoxD10啟動子甲基化狀態與GC患者性別、年齡、Karnofsky功能狀態評分標準（KPS評分）無相關。腫瘤直徑>5cm、病理分級為高級別（III～IV級）、幽門螺桿菌感染、血清CA19-9與血清CEA陽性患者的HoxD10啟動子甲基化陽性率明顯更高。Kaplan-Meier生存曲線表明，HoxD9啟動子甲基化陽性GC患者比HoxD9啟動子甲基化陰性GC患者的40個月生存率明顯降低。在高級別（III～IV級）GC患者中，HoxD9啟動子甲基化陽性者的生存率明顯降低，在低級別（I～II級）GC患者中，HoxD9啟動子甲基化陽性者的生存率也明顯降低。本研究明確了血漿HoxD10啟動子甲基化在GC早期診斷中的作用，則可將上述項目作為臨床檢測指標進行推廣，指導臨床早期篩選高危人群，早期診斷、早期干預治療，延緩GC進展，最終達到提高患者生活質量，提高醫療質量，擴大醫療服務范圍，節約衛生資源的目的，同時提高醫院的經濟和社會效益。

綜上所述，HoxD10基因在GC中表達均下降，外周血中游離DNA HoxD10甲基化陽性率能夠反映GC組織中的甲基化水平以及GC患者的生存情況。HoxD10啟動子甲基化水平有可能為GC的早期診斷提供重要依據。