卡鉑-PECE水凝膠預防大鼠腹腔粘連的實驗研究

張亞 楊炳

(1.遵義醫科大學附屬醫院婦產科，貴州 遵義563000;2.貴州省腫瘤醫院婦瘤外科，貴州 貴陽 550001)

腹腔粘連在臨床上較為常見,是腹部手術后的常見并發癥，其發生率約為67%～93%[1]。盡管大多數腹腔粘連的癥狀不明顯，但粘連可以導致不孕、慢性盆腹腔痛及腸梗阻，并增加再次手術的難度[2]。不僅如此，還可以降低腫瘤細胞減滅術后的腹腔化療效果甚至是化療失敗。對于晚期盆腹腔惡性腫瘤如卵巢癌、輸卵管癌及其它腹腔癌癥而言，盡管腫瘤細胞減滅術為后續的腹腔化療創造了有利條件，但該類手術卻導致了廣泛的腹膜缺損，繼而形成廣泛的腹腔粘連，不僅影響了化療藥物在腹腔內的分布，而且還降低了腹腔化療的效果甚至是化療失敗[3]。腹腔化療常用的順鉑、卡鉑等抗癌藥物因分子量小而易于通過腹膜被快速吸收從而削弱了腹腔給藥的優勢。因此，如何預防術后的腹腔粘連從而增加化療效果是一個值得探究的問題。我們此前的研究已經證實PECE水凝膠具有良好的生物相容性、生物可吸收性及預防腹腔粘連的的特性，其在低溫(10℃)時呈液態，易于和藥物混合，而在37℃左右則呈凝膠狀，易從注射器中擠出并能夠不受空間限制地粘附到腹膜創面上。本實驗將卡鉑-PECE水凝膠應用于動物模型以了解裝載卡鉑的PECE水凝膠是否仍具有預防腹腔粘連的防粘效果。從而為腫瘤細胞減滅術后預防腹腔粘連的治療模式提供理論依據。

1 材 料

1.1實驗動物 Wistar雌性大鼠重約240～260 g。所有大鼠在使用前均經過正規檢疫。對照組：卡鉑組：雌性大鼠重約240～260 g 隨機分配15只；治療組：卡鉑-PECE水凝膠組：雌性大鼠重約240～260 g 隨機分配15只。

1.2主要藥品及試劑 卡鉑(Carboplatin)粉針劑購自齊魯制藥有限公司；聚乙二醇-聚己內酯-聚乙二醇(PEG-PCL-PEG,PECE)共聚物；Masson染色試劑。

1.3實驗方法

1.3.1卡鉑-PECE水凝膠的制備及電鏡觀察 25wt % PECE水凝膠的制備：稱取一定量的PECE共聚物，加入生理鹽水充分攪拌均勻并在75 ℃溫度下溶解，配制成濃度為25wt %水凝膠，4 ℃保存備用。卡鉑-PECE水凝膠的制備：低溫時25wt % PECE水凝膠呈流動的溶膠態，加入一定量的卡鉑并充分攪拌混勻配制成濃度為1 mg/mL的卡鉑-PECE水凝膠。掃描電鏡檢測：將所制備的卡鉑-PECE水凝膠(1 mg/mL)低壓凍干72 h后，液氮淬斷、噴金，SEM觀察。

1.3.2卡鉑-PECE凝膠抗粘療效觀察 大鼠腹壁缺損—盲腸摩擦模型的建立參考文獻報道[4]進行。使用10%水合氯醛按每公斤體重(0.3 mL/100 g)進行麻醉，麻醉生效后大鼠取仰臥位，備皮、消毒后取腹部正中切口，逐層切開腹壁及腹膜，識別盲腸并用消毒干紗布摩擦盲腸漿膜層直至創面有點狀出血以形成一面積約為3 cm2的漿膜缺損區域。然后將盲腸放回腹腔，用手術刀在右側腹壁上制造一2 cm×3 cm大小的腹膜缺損，將兩個創面并行排列，并用3/0絲線縫合以誘導粘連形成。按上述方法制作30只大鼠模型，隨機分為卡鉑組(60 mg/kg)和卡鉑-PECE水凝膠組(60mg/kg)，各組15只。術后不同時間處死大鼠，按下述標準采用雙盲法進行粘連評分[5]：0分：無粘連；1分：薄膜樣粘連；2分：固定的局部粘連；3分：致密的累及多個臟器的粘連；4分：累及腹壁及內臟的致密粘連。為進一步了解卡鉑-PECE水凝膠防粘作用的動力學，我們又制作了18只模型大鼠并用卡鉑-PECE水凝膠處理創面并于術后1、3、5、7、9、12 d處死大鼠以觀察有無腹腔粘連的形成、凝膠的降解吸收和創面的修復，同時探索其預防粘連的機制。

1.3.3組織學分析 處死大鼠后，剖視腹腔并進行肉眼觀察，切取受傷的腹壁、盲腸以及與粘連相關的腹壁和盲腸。生理鹽水清洗后修剪組織并固定于中性福爾馬林緩沖液，48 h后脫水、石蠟包埋，制成病理切片，分別行Masson染色病檢。此外，心、肝、脾、肺、腎、腸、胃等組織也一并行病檢HE染色。HE染色：(1)切片在二甲苯中脫蠟10 min，脫蠟共兩次；(2)移入100%、95%、85%、70%酒精，梯度酒精各為2～5 min，最后經蒸餾水轉入染液；(3)蘇木精染液染色5～15 min；(4)水洗玻片上多余染液，0.5%～1%鹽酸酒精(70%酒精配制)分色片刻。鏡檢控制，直至細胞核及核內染色質清晰為止，約數10 s；(5)流水沖洗15～30 min，使細胞核呈藍色；(6)蒸餾水短洗；(7)0.1%～0.5%伊紅染液染色1～5 min；(8)依次經70%、85%、95%、100%酒精脫水，各級為2～3 min；(9)二甲苯透明(兩次)，共約10 min；(10)封片：擦去切片周圍多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加適量中性樹膠，再加蓋玻片封固。Masson染色：(1)常規脫蠟至水；(2)置Bouin液室溫過夜，流水沖洗至黃色消失，然后用蒸餾水沖洗；(3)Ⅰ液5 min，蒸餾水沖洗；(4)Ⅱ液15 min，Ⅲ液5 min，蒸餾水沖洗；(5)1%冰乙酸溶液浸泡5 min；(6)無水乙醇5 min，自然干燥過夜，中性樹膠封片；備觀察。

1.3.4毒副作用觀察 為了評估卡鉑-PECE水凝膠治療對大鼠可能引起的毒副反應，實驗期間觀察各組動物的生存狀態，如有無厭食、腹瀉、活動減少及腹壁切口愈合狀況等。

1.4統計學方法 因治療組及對照組的粘連評分并不符合正態分布，所以統計分析采用Mann-WhitneyU-tests和Fisher’sexacttest。所有統計分析中以P<0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1物理特性 粉末狀卡鉑與25wt %水凝膠混合后，低溫時(10℃)呈流動的溶膠態，在37℃時呈凝膠態。將卡鉑-PECE水凝膠低壓凍干后行掃描電鏡檢查，可見水凝膠內有大量的微孔，這種結構允許藥物分子進入凝膠骨架，將凝膠置于水中或凝膠結構降解時藥物分子也可以從骨架中彌散出來。為動物實驗所使用的卡鉑-PECE水凝膠(1 mg/mL)。

2.2卡鉑-PECE水凝膠的防粘效果 30只大鼠接受腹壁缺損—盲腸摩擦手術，并被隨機分為兩組，一組接受單純的卡鉑溶液治療，另一組接受卡鉑-PECE水凝膠治療(圖1B)。手術后15 d處死所有動物并進行腹腔粘連粘連評分。15只卡鉑-PECE治療的大鼠中，無粘連形成(P<0.001，P<0.01)。其中位粘連評分明顯低于對照組(P<0.001)。全部卡鉑-PECE凝膠治療的壁層腹膜和臟層腹膜缺損完全恢復正常，腹腔中也未發現水凝膠殘余物出現。

2.3防粘動力學觀察 經過卡鉑-PECE水凝膠處理的模型大鼠中仍未出現腹腔粘連。伴隨著時間的延長，粘附于腹壁和盲腸創面的水凝膠分別于術后的3～5 d和5～7 d逐漸消失(圖2A～C)。伴隨著創面凝膠的消失，術后第3天腹腔內可見粘稠液體并逐漸增多，第5天達到高峰圖2C)，又在隨后的7 d內完全吸收(圖2D)。伴隨著水凝膠的降解和吸收，壁層腹膜和臟層腹膜創面分別于治療后第5天和第9天愈合(圖2C～E)，其外觀在手術后第12天恢復正常(圖2F)。

2.4腹膜創面修復過程中的病理觀察 卡鉑-PECE水凝膠治療后第3天，可以看到壁層腹膜創面上覆蓋一層水凝膠，伴炎細胞浸潤及大量的核固縮的凋亡細胞，水凝膠下方可見極少量的散在的膠原蛋白沉積。治療后第5天，主要有巨噬細胞和泡沫樣巨噬細胞構成的炎性細胞層出現，該細胞層仍含有大量的凋亡細胞。在隨后的7 d內，富含膠原和成纖維母細胞的結構代替了炎性細胞層，該層結構內依然有大量的凋亡細胞，并于術后第12天在該層結構的上方見到完整間皮細胞層。見圖3。

圖3 腹膜創面修復過程中的病理觀察

2.5毒副作用觀察 對于腹腔粘連模型大鼠而言，為了觀察卡鉑-PECE凝膠治療是否增強了卡鉑對重要臟器明顯的毒副作用，切取大鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、輸卵管等臟器并制成病理切片，HE染色后在光學顯微鏡下觀察，沒有發現明顯的異常改變。見圖4。

注：A～H分別表示卡鉑-PECE凝膠組大鼠心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸及輸卵管組織的HE染色圖，未發現明顯的異常改變。圖4 HE染色圖

3 討 論

腹腔粘連是手術對腹膜損傷不可避免的并發癥。創傷啟動了炎癥反應，伴隨著富含纖維蛋白的滲出增多，在腹膜創面形成纖維蛋白性基質性粘連。如果纖溶酶級聯反應功能下降，成纖維母細胞侵入纖維素樣粘連并分泌膠原蛋白，最終導致牢固的纖維化粘連的形成對于腹腔粘連的藥物治療而言，而纖溶酶制劑有增加出血的危險，抗炎藥卻延遲了腹膜創面的愈合[6]。因此，為了預防粘連形成，專家推薦術后使用防粘屏障[7]，防粘屏障從形態上分為粘稠聚合溶液、預形成的固體膜片和原位交聯水凝膠等，使用時將它們覆蓋在受累的組織器官表面以減少相鄰器官的接觸。對于聚合溶液而言，因其在所應用部位的滯留時間較為短暫而療效不佳[8]。對固體膜片而言，應用時需將膜片置放于腹膜創面并需縫合固定及徹底止血，不僅增加了手術難度，而且由于縫線反應還增加了腹腔粘連的機會[9]。此外，膜片長時間的腹腔滯留(>31 d)可能會對健康造成潛在危害。因此，由于這些缺陷而使上述防粘劑的臨床應用受到限制。目前尚未找到理想而有效的藥物。理想的防粘屏障不僅高效，而且還應該具備生物相容性和生物可吸收性。臨床上腹腔粘連不僅導致不孕、慢性盆腹腔痛及腸梗阻等并發癥，還可以降低腫瘤細胞減滅術后的腹腔化療效果甚至是化療失敗[10]。此次大鼠模型試驗結果表明：裝載卡鉑的PECE水凝膠仍然具有良好的防粘效果及生物相容性和生物可吸收性；首先，溶膠態的卡鉑-PECE水凝膠很容易從注射器中擠出并能夠不受空間限制地粘附到腹膜創面上，在體溫下很容易地形成柔軟的膜樣結構，該過程不需要添加交聯劑或紫外線照射，這些特征使水凝膠不僅方便在開腹手術，而且還方便在腹腔鏡手術中應用。其次，正是由于卡鉑-PECE水凝膠的使用，不僅有助于延遲成纖維母細胞的入侵，同時在腹膜創面的間皮化過程中發揮重要作用?？ㄣK-PECE水凝膠預防腹腔粘連的關鍵在于間皮細胞層的修復重建。正常情況下，壁層腹膜的間皮化時間需要5～6 d，而臟層腹膜的間皮化時間需要5～8 d[11]?？紤]可能和卡鉑的局部應用延遲了腹膜間皮化過程有關，但是并不影響其預防腹腔粘連的效果。此外在手術后12天仍能夠觀察到炎性細胞層中的很多凋亡細胞。從而表明裝載了卡鉑的PECE水凝膠具有良好的藥物緩釋特性，可能意味著裝載卡鉑的PECE水凝膠能夠提高卡鉑的腹腔化療效果。

在卡鉑-PECE水凝膠治療的大鼠中，不僅卡鉑-PECE水凝膠應用部位沒有發生粘連，而且沒有應用卡鉑-PECE水凝膠的腹壁切口也未出現粘連。相反，對照組的腹腔粘連不僅出現在相鄰腹膜創面之間，而且還出現在腹壁切口和正常腹膜之間。卡鉑是一種細胞毒性藥物，可以對全身重要臟器有潛在毒性作用，但是，本實驗結果表明將卡鉑裝載于PECE水凝膠中進行腹部應用并未增加對重要臟器的毒性作用。本實驗證實載有卡鉑并具有緩釋特性的PECE水凝膠能有效地預防腹腔粘連的發生。這意味著對諸如晚期卵巢癌、輸卵管癌以及其它腹膜癌癥的手術創面涂抹載有卡鉑的PECE水凝膠能夠起到防粘效果，并為以后的腹腔化療創造了有利條件。