1,6二磷酸果糖聯(lián)合高壓氧對大鼠缺氧缺血性腦病的治療①

孫昂昂，劉東璞，呂晉元

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

新生兒缺氧缺血性腦病是指在圍產(chǎn)期缺氧引起的缺氧缺血性腦損傷，出現(xiàn)一系列腦病的表現(xiàn)[1]，是新生兒神經(jīng)功能障礙及死亡的首要原因，可導(dǎo)致終身神經(jīng)發(fā)育不良，如腦癱、認(rèn)知障礙和智力遲鈍。有氧呼吸是腦的能量來源重要部分，新生兒腦的代謝最強(qiáng)，但糖含量很少，所以腦代謝最先受到缺氧的影響。1，6二磷酸果糖(Fructose 1,6 diphosphate，F(xiàn)DP)是糖酵解途徑產(chǎn)生的葡萄糖代謝內(nèi)源性中間體，能夠改善細(xì)胞內(nèi)線粒體能量代謝，穩(wěn)定細(xì)胞膜，減少氧自由基產(chǎn)生，保護(hù)腦細(xì)胞。與常壓氧相比，高壓氧(Hyperbaric oxygen，HBO)可以為HIE腦組織提供足夠的氧氣。在許多實(shí)驗(yàn)性腦損傷的研究中，HBO治療比常壓氧能產(chǎn)生更好的結(jié)果，HBO被認(rèn)為是治療HIE較為有效的方案[2]。7d大鼠大腦發(fā)育與新生兒期相近，本實(shí)驗(yàn)觀察FDP、HBO以及二者聯(lián)合應(yīng)用對HIE大鼠腦組織病理變化及Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

出生7d SD大鼠60只(14～16)g，雌雄不限，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，1,6二磷酸果糖，高壓氧裝置，兔抗鼠Bcl-2抗體、Bax抗體，萊卡光學(xué)顯微鏡。

1.2 分組

將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、缺氧缺血組(HIE組)、1，6二磷酸果糖治療組(F組)、高壓氧治療組(H組)、1，6二磷酸果糖聯(lián)合高壓氧治療組(F+H組)。麻醉后參照改良Rice等[3]的方法，結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，置于厭氧罐中1h，制成HIE模型。如果小鼠動作緩慢，平衡性差，翻身困難，則認(rèn)為模型的建立是成功的。S組，僅分離雙側(cè)頸總動脈。F組，予FDP 250mg-1·kg-1，腹腔注射。H組，予1 Kpa HPO 2h。F+H組，同時予以上2種干預(yù)。所有干預(yù)治療每日進(jìn)行1次連續(xù)治療7d。術(shù)中、術(shù)后因出血、麻醉過深、母鼠咬死等原因死亡15只，HIE組5只最多，S組兩只最少，最后45只完成實(shí)驗(yàn)。

1.3 體質(zhì)量增長率測定

7d齡、14d齡分別稱重大鼠并計算體質(zhì)量增長率。體質(zhì)量增長率=(14d齡體質(zhì)量-7d齡體質(zhì)量)÷7d齡體質(zhì)量。

1.4 標(biāo)本制作及形態(tài)學(xué)觀察

14d齡時，麻醉后打開胸腔，剪開右心耳，心尖部插管，注入生理鹽水，流出液清亮后，注入4%多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦，固定、脫水、包埋、制作常規(guī)石蠟切片，HE染色觀察腦組織形態(tài)學(xué)改變。

1.5 免疫組化法檢測陽性細(xì)胞數(shù)

采用En Vision兩步法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)，均定位在胞質(zhì)，為棕黃色顆粒樣著色。每組選取兩張切片在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取6個視野計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，采用IPP 6.0圖像分析軟件計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體重增長率

14d 時，HIE組、F組、H組、F+H組體重低于S組(P<0.05)；與HIE組相比，F(xiàn)組、H組體重增長(P<0.05)；與F組相比，F(xiàn)+H組體重增長(P<0.05)；與H組相比，F(xiàn)+H組體重增長(P<0.05)；F組、H組體重增長差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。HIE組體重增長率低于S組(P<0.05)；與HIE組相比，F(xiàn)組、H組體重增長率增加(P<0.05)；與F組相比，F(xiàn)+H組體重增長率增加(P<0.05)；與H組相比，F(xiàn)+H組體重增長率增加(P<0.05)；F組、H組體重增長率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 新生大鼠缺氧缺血組與治療組體重增長情況

2.2 病理學(xué)改變

光鏡觀察：S組腦組織結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞核膜完整、核仁清楚；HIE組神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目減少，排列紊亂，Nissl小體消失，胞膜皺縮，胞質(zhì)濃縮變暗，核固縮、深染，間質(zhì)水腫；皮質(zhì)、海馬有膠質(zhì)細(xì)胞增生，可見篩狀軟化灶、衛(wèi)星現(xiàn)象；與HIE組相比，F(xiàn)組、H組、F+H組神經(jīng)元損傷減輕；見圖1。

S組 HIE組 F組

H組 F+H組

2.3 免疫組化結(jié)果

與S組相比，HIE組Bcl-2表達(dá)減少(P<0.05)，Bax表達(dá)增加(P<0.05)；F組、H組較HIE組Bc1-2表達(dá)均增加(P<0.05)，Bax表達(dá)減少(P< 0.05)；與F組相比，F(xiàn)+H組Bcl-2表達(dá)增加(P<0.05)，Bax表達(dá)減少(P<0.05)；與H組相比，F(xiàn)+H組Bcl-2表達(dá)增加(P<0.05)，Bax表達(dá)減少(P<0.05)；F組、H組Bcl-2、Bax表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2～3、表2。

S組 HIE組 F組

H組 F+H組

S組 HIE組 F組

H組 F+H組

表2 免疫組化檢測大腦皮層凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)

3 討論

7d齡大鼠腦發(fā)育與人類的出生階段相當(dāng)，模擬新生兒HIE。新生兒HIE發(fā)病率很高，患病后如果無法得到及時治療，會引起胎兒死亡[4]。能量衰竭是HIE發(fā)病機(jī)制的首發(fā)環(huán)節(jié)。腦組織供氧不足，無氧酵解導(dǎo)致乳酸堆積，使受損神經(jīng)細(xì)胞不可逆損傷。凋亡過程可持續(xù)21d以上，及時阻斷，可阻止神經(jīng)細(xì)胞遲發(fā)性死亡，減少神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生[5]。恢復(fù)神經(jīng)細(xì)胞正常能量代謝是治療HIE的首要方法。FDP可跨越血腦屏障為缺氧組織提供能量來源，改善細(xì)胞代謝，促進(jìn)缺氧細(xì)胞的恢復(fù)，對大腦、心肌細(xì)胞以及肝細(xì)胞等起到保護(hù)作用，已被證實(shí)在輔助治療心肌受損性疾病方面確有療效。

高壓氧被證明在與一般缺氧及其相關(guān)的急性條件下是有益的，如一氧化碳中毒、循環(huán)停止和局部缺血缺氧。高壓氧治療有助于受影響的大腦的自我保護(hù)和恢復(fù)，并通過抑制線粒體依賴的細(xì)胞凋亡來保護(hù)大腦免受缺血損傷。高壓氧治療可減輕缺氧缺血引起的神經(jīng)損傷，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的長期神經(jīng)功能恢復(fù)[6]。高壓氧治療通過促進(jìn)腦細(xì)胞增殖或抗凋亡和抗氧化應(yīng)激具有神經(jīng)保護(hù)作用[7]。 高壓氧可以通過改善對血流減少區(qū)域的供氧來對抗缺氧；通過減少缺氧缺血，HBO減少了缺氧導(dǎo)致的所有病理事件，包括組織水腫、區(qū)域通透性增加、組織代謝后紊亂、炎癥等。可能直接影響對氧或缺氧敏感的細(xì)胞凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)。高壓氧在細(xì)胞水平上提供了一個氧庫，它不僅由血液攜帶，而且通過從組織間組織擴(kuò)散而來，達(dá)到高濃度，可持續(xù)數(shù)小時，改善內(nèi)皮功能和流變學(xué)，減少局部炎癥和水腫。

Bcl-2是凋亡抑制基因，Bax是促凋亡基因，Bcl-2和Bax的比例，是評價細(xì)胞凋亡程度的可靠指標(biāo)。本研究表明治療組Bcl-2表達(dá)增加，F(xiàn)DP與HBO聯(lián)合應(yīng)用明顯增加，Bax表達(dá)減少，F(xiàn)DP與HBO聯(lián)合應(yīng)用明顯減少。FDP與HBO聯(lián)合應(yīng)用，可以使HIE腦組織缺氧狀態(tài)得到改善，減輕腦組織損傷，但機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。