晚期非小細胞肺癌外周血EGFR基因檢測與腫瘤抗原標志物臨床價值①

王 莉，任秀英，牟洪香，辛 華

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

非小細胞肺癌(NSCLC)是具有高度異質性的一種惡性腫瘤疾病。對于非小細胞肺癌的治療當中，作用于表皮生長因子受體的酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)起到重要的作用[1,2]。而外周血EGFR基因突變是作為口服EGFR-TKI療效預測的一個最有效的因子，有研究也提示外周血EGFR基因的突變與血CEA間存在有關聯性[3,4]。本文主要以探究原發性非小細胞肺癌(NSCLC)患者外周血EGFR基因檢測與腫瘤抗原標志物臨床價值，為晚期NSCLC患者的EGFR基因檢測以及治療選擇提供參考思路。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2017-09～2018-09收治的NSCLC患者中的80例作為本次研究對象。其中包括男46例、女34例，年齡41～80歲，平均(61.45±6.27)歲，其中存在吸煙史患者42例、無吸煙史38例。納入患者包括其中肺腺癌57例、非腺癌23例。TNM分期中，Ⅲ期32例、Ⅳ期48例。納入患者均經臨床確診NSCLC，且對于研究內容均知情且自愿參與本研究，患者均簽署知情同意書，本實驗經醫院倫理委員協會的批準。

1.2 研究方法

(1)外周血EGFR基因檢測。于晨間空腹狀態下采集所有患者的10mL全血，將采集到的血液置于EDTA管當中，通過2000r/min離心機下進行離心處理15min，取上清置2000r/min離心機中再次離心處理10min，分離血漿與血細胞，將樣品置于-80℃冰箱當中進行保存備用。血漿當中的循環腫瘤DNA抽提通過DNA專用提取試劑盒(CatNO23211，上海允英公司生產)進行提取，獲得產物應用Qubit(LifeTechnology公司)進行濃度檢測，根據檢測的實際濃度進行調整，使最終濃度在2～52ng/μL，當檢測濃度過高則應用純水稀釋，濃度過低則進行重新提取。通過PCR技術對外周血EGFR基因的突變情況進行檢測，檢測過程以腫瘤DNA(微量)作模板，應用阻遏分子對EGFR野生型的位點進行封閉，使在PCR時突變的特異引物通過基因組作為模板，對突變的靶序列進行PCR高精度擴增，同時利用熒光探針Taqman-MGB對擴增的產物進行準確檢測，于實時PCR平臺上，對樣本DNA當中基因EGFR的突變情況進行檢測，在每次進行PCR反應中對所有的樣品、陽性對照以及無模板對照進行共同分析。檢測依次以95℃10min，1個循環；95℃10s、60℃50s，15個循環；95℃10s、60℃50s，35個循環；在第三階段的60℃時，對FAM信號與HEX信號進行收集，進行實時PCR并對檢測文件進行保存。(2)腫瘤抗原標志物檢測。空腹下抽取患者肘靜脈血3mL，通過3500r/min離心機離心處理10min后取上清液，應用羅氏2010型全自動電化學發光免疫分析儀進行檢測，過程使用配套的試劑。通過電化學發光法對血清神經元特異性烯醇化酶(NSE)、癌胚抗原CEA(CEA)、非小細胞肺癌抗原(CYFRA21-1)、糖基抗原CA-125(CA-125)以及鱗狀細胞癌抗原(SCCAg)表達水平進行檢測[5]。

1.3 觀察指標

對基因突變的結果判斷：按依據檢測說明書操作，在EGFR檢測中，每次試驗均提前設定空白對照、野生型對照與各突變陰陽性檢測的結果作為檢測的參照，確定樣品的各反應管中突變的Ct值與外控Ct值。ΔCt=突變Ct-外控Ct。當Ct≥24則EGFR基因突變檢測陰性，Ct<20則EGFR基因突變檢測陽性，當20≤Ct<24則EGFR基因突變為可疑陽性，此時分析ΔCt值，ΔCt<10則突變為陽性。

1.4 統計學方法

采用SPSS16.0統計學軟件進行分析，計數資料形式n(%)表示，對比行χ2檢驗；計量資料以均值±標準差進行描述，對比行t檢驗；P<0.05為差異具統計意義。

2 結果

2.1 非小細胞肺癌患者的EGFR基因突變檢測

80例NSCLC患者的EGFR基因突變檢測結果中，陽性33例、陰性47例，基因突變率41.25%。EGFR基因突變情況多見于肺腺癌與女性患者(P<0.05)。見表1。

表1 非小細胞肺癌患者的EGFR基因突變檢測

2.2 外周血EGFR基因突變與患者血清腫瘤標志物水平關系

EGFR基因突變陽性患者的CEA值顯著高于EGFR基因突變陰性(野生型)患者(P<0.05)，而SCCAg值則顯著低于EGFR基因突變陰性患者(P<0.05)；EGFR基因突變陽性患者的CYFRA21-1、CA-125以及NSE表達水平與EGFR基因突變陰性患者的對比均為見顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 外周血EGFR基因突變與患者血清腫瘤標志物水平關系

3 討論

作用于表皮生長因子受體的酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)在對EGFR基因敏感突變的非小細胞肺癌(NSCLC)患者時治療時，其療效顯著優于傳統的化療治療[6]。而由于組織活檢樣本具有一定的局限性，對于不少高齡患者在診斷時已無法進行手術因此無法獲取標本，加之氣管鏡的取材較小，穿刺本身存在較大風險，對于某些腫瘤的解剖位置以及肺部的基礎疾病影響而不適于進行穿刺，反復取材使患者難以接受等，病理組織不適用于長期治療，因此，有必要選擇應用更合適的方法對EGFR-TKI療效進行預測[7,8]。在當前，液體腫瘤學檢測的侵害性小、操作可行性較強、且同時具實時動態監測的特點，在臨床上越來越受關注。循環腫瘤DNA(ctDNA)是由腫瘤細胞凋亡與壞死而被直接釋放到外周血當中的一種DNA片段，其中攜帶著大量與腫瘤組織存在相關的信息，對其檢測能對EGFR-TKI療效起到一定的預測價值。且由于ctDNA源于腫瘤的原發灶以及轉移灶壞死、凋亡的腫瘤細胞碎片，因此對其檢測也能夠避免腫瘤組織遺傳異質性，體現整個非小細胞肺癌腫瘤遺傳學的特征。在本研究80例NSCLC患者的EGFR基因突變檢測結果中，陽性33例、陰性47例，基因突變率41.25%。EGFR基因突變情況多見于肺腺癌與女性患者(P<0.05)。且EGFR基因突變與年齡、吸煙史、TNM分期在本研究中均未見相關性。而腫瘤抗原標志物作為由腫瘤細胞生物合成并釋放的物質，癌胚抗原(CEA)可作為肺癌患者一個獨立的預后因素，血清中CEA的表達水平與NSCLC治療療效以及腫瘤侵襲轉移存在一定的相關性。有研究提示血清CEA濃度與EGFR基因突變檢測陽性呈線性關系，EGRF基因突變可使下游信號通路激活，加速癌細胞的分化致，CEA蛋白表達水平升高。本研究發現EGFR基因突變陽性患者的CEA值顯著高于EGFR基因突變陰性(野生型)患者(P<0.05)，研究提示CEA可能與高EGFR突變存在有關性。研究也提示EGFR基因突變陽性患者的SCCAg值則顯著低于EGFR基因突變陰性患者(P<0.05)。SCCAg作為鱗癌的一種特異性標記物，在腺癌當中的表達水平相對較低，而EGFR基因突變更多見于腺癌，因此，結合研究結果可提示EGFR突變患者的血清SCCAg表達水平會出現降低。

綜上所述，血清中腫瘤抗原標志物CEA濃度水平的升高、SCCAg表達水平下降與EGFR基因突變存在相關性，對血清CEA與SCCAg的檢測可對EGFR基因突變的預測起到一定的效果，臨床可結合優勢人群選擇使用EGFR-TKIs進行治療，臨床行血漿EGFR基因檢測具有較高的實用價值。